IFN 唐古特白刺果多糖与黑果枸杞多糖对免疫受抑小鼠

引言

唐古特白刺果（ Nitraria tangutorum Bobr NTB ）为蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺属（Nitraria）落叶灌木植物,据大量文献报道出 NTB已从果籽到果皮进行了系统的研究，发现它具有抗氧化、抗疲劳、降血脂、耐寒冷、调节免疫功能等作用[1]。在免疫学研究方面，认为它主要有显著增强小鼠单核巨噬细胞吞噬功能和小鼠血清溶血素生成的作用，樊莲莲等［2］采用亚急性衰老模型小鼠灌胃白刺果中总黄酮发现它具有抗氧化、延缓衰老的作用。索有瑞等［3］研究出白刺果实具有调节免疫、抗疲劳和耐寒冷等作用。白刺中提取的籽油还可使小鼠负重游泳时间显著延长，运动后血乳酸含量比对照组小鼠低40%，而肝糖元含量显著增高［4］。他们还对［5］对唐古特白刺提取的籽油进行了动物实验发现它具有保护化学性肝损伤作用，但唐古特白刺果对 IFN-γ、T/N细胞的影响尚未涉及。T 细胞在细胞免疫中发挥着重要作用, 它还参与 B 细胞产生抗体的过程。特别是辅助性 T 细胞(T helper、 Th、CD4+)和抑制性 T 细胞(T suppressor、Ts、 CD8+)在免疫应答过程中起着至关重要的作用，其比值(T4/T8 比)对判断免疫平衡是常用指标。而自然杀伤细胞(natural iller cell， N)是固有免疫系统中一类十分重要的淋巴细胞、约占淋巴细胞总数的 15%。N 细胞通过发挥细胞毒作用和分泌细胞因子，在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥着重要的免疫功能。本实验从这方面入手，在与具有抗疲劳、耐缺氧、降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、能够提升巨噬细胞吞噬指数的黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.LRM）系茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium L.）多年生棘刺灌木进行对照的情况下，提取具有多种生物活性并且在免疫方面具有与众不同功能的多糖（polysaccharide）来探讨 NTB 多糖对 IFN-γ、T/N 细胞的影响。NTB 及 LRM 的免疫学研究尚处于起步阶段，关于报道不多，故本研究通过NTB 及 LRM 多糖治疗前后免疫受抑小鼠外周血 IFN-γ，T/N 的变化，探讨 NTB多糖及LRM多糖的免疫调整机理并为NTB及LRM相关产品的开发提供实验依据。结合目前国内外处于亚健康现实且其免疫力低下人群逐年增多的实际状况，可开发 NTB 及 LRM 系列保健产品，使 NTB 及 LRM 资源得到综合利用。

第一章 超声-微波协同提取唐古特白刺果多糖与黑果枸杞多糖

超声波是一种机械波，它是一种通过强烈震动、空化作用等物理过程来提取有效成分的分离技术，通过超声波的热效应及搅拌作用促使溶剂分子渗透到组织细胞中，从而使得活性成分被释放[6]。微波提取具有选择性高、提取时间短及易挥发性成分的提取率高等优点[7-8]。但每一种提取方法都有它不足之处，如微波提取时遇到的受热不均等现象。超声-波微波协同提取是近年来较新型的提取方法，因其有提取率高、提取时间短、提取物结构受影响程度低等优点，已被广泛应用在生物活性物质的提取方面[9-10]。目前尚未见采用超声-微波协同法提取 NTB 多糖，但汪河滨等[11]对 LRM 多糖提取采用了此方法。故本实验采用此方法提取 NTB 多糖及 LRM 多糖进行对比。

1.1 材料与方法1.1.1 实验原料2021 年 8 月采自柴达木盆地天然白刺林场，黑果枸杞购自诺木洪个体户。烘干后常温储存。（原植物经中国科学院西北高原生物研究所索有瑞研究员鉴定为柴达木产唐古特白刺果及黑果枸杞）本试验所用试剂除特别标出的外，均为分析纯，购于试剂公司。

第二章 NTB 多糖与 LRM 多糖对免疫受抑小鼠 IFN- 、T/N 细胞的影响 .......92.1 实验材料...................................................92.2 实验动物及分组............................................102.3 小鼠脾脏、胸腺重量及组织结构观察察........................102.4 小鼠脾细胞 IFN- 提取 ......................................112.5 小鼠血清 IFN- 的测定 ......................................122.6 T/N 细胞亚群分析 .........................................122.7 数据处理..................................................122.8 结果......................................................12第三章 讨论 ......................................................183.1 免疫抑制低下动物模型的建立.................................223.2 NTB 多糖与 LRM 多糖对免疫受抑小鼠免疫调节作用 ...............233.3 结论.......................................................24

第二章 NTB多糖与LRM多糖对免疫受抑小鼠IFN- 、T/N细胞的影响

2.2 实验动物及分组昆明种小鼠 40 只，清洁级，质量（25±2）g，雌雄各半；购自青海省地方病研究所。随机分为 4 组,正常对照组、模型组、模型+NTB 多糖组和模型+LRM多糖组，每组 10 只，每日定时注射 1 次，模型+NTB 多糖组及模型+LRM 多糖组腹腔注射环磷酰胺 70mg/g 连续 5 天，造模后腹腔注射 NTB 多糖及 LRM 多糖3.6g/g[13]连续 10 天。模型组腹腔注射环磷酰胺 70mg/g 连续 5 天。正常对照组腹腔注射同等量生理盐水。末次给药 24h 后断颈采血，称取脾和胸腺重量，取外周血测定 CD3、CD4、CD8、N 细胞、血清 IFN-γ及 IFN-γmRNA 的测定。实验期间小鼠自由进食和饮水。

2.3 小鼠脾脏、胸腺重量及组织结构观察末次给药24h后，断颈处死各组小鼠，无菌取出脾脏和胸腺，小心清除脾脏及胸腺附着结蹄组织，用生理盐水清洗，吸水纸吸干水分后用分析天平称重，计算脾脏指数及胸腺指数。脾脏称重后固定做石蜡切片（详细按石蜡切片实验步骤操作），10X显微镜下观察淋巴滤泡及其结构。按上述方法取出脾脏后制成脾细胞悬液，采用 Trizol 试剂盒按说明书操作提取总 RNA。所提 RNA 溶于 DEPC 处理水 50μl 溶解，用 5μl 在紫外分光光度计下检测 RNA 的纯度以及定量，总 RNA-80℃保存备用，其余-20℃保存备用。

2.4.1 逆转录（RT）反应合成 cDNA取上述 mRNA 溶液 10μl，按照逆转录试剂盒操作进行 cDNA 扩增，反应产物即 cDNA -20 ℃保存备用（引物序列见表 1）。

2.4.3 PCR 产物定量取 PCR 扩增产物 20μl 经 5%琼脂糖凝胶电泳，1%GelGreen 显色后用 Bio Radmycycler 凝胶扫描仪对电泳凝胶中的 PCR 产物条带进行密度扫描，以 β-actin作为 RT-PCR 的质控，计算 IFN-γ的 mRNA 与其对应的 β-actin 峰面积的比值，从而得 NTB 多糖及 LRM 多糖对免疫机制低下小鼠的 IFN-γmRNA 表述的变化。

2.5 小鼠血清IFN- 的测定上述剩余外周血 0.5ml 分离血清备用。采用双抗体夹心法心 ELISA 法测定血清中 IFN-γ的含量，取 50μl 血清稀释 3 倍后加入酶标板。(具体操作按 ELISA试剂盒说明书严格操作)。

2.6 T/N细胞亚群分析外周血 T 细胞亚群的检测小鼠断颈取血约 0.5ml 用肝素抗凝，取 200μl 抗凝血加入单克隆抗体 CD3、CD4、CD8 和 N(CD49b)荧光标记单克隆抗体 20μl充分混匀，避光孵育 20～35 min 后,标记后的样品分别加入红细胞裂解液,白细胞( WBC) 稳定剂及细胞膜固定剂进行处理后，应用 Becton Dicinson 公司 FACSCalibur 流式细胞仪上机检测。

第三章 讨论

参考文献（略）