胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血脑损伤模型中的研究

第一部分：胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血性脑损伤模型中治疗效果观察

材料和方法

一、实验材料(一）实验动物10只健康妊娠16-8d的Wistar大鼠用于PD-MSCs和成纤维细胞的获取。选择标准动物房常规饲养的刚出生7日龄的健康体况的Wistar型大鼠，体重13.27±1.34g，不限雌体、雄体地随机将大鼠分为4组，分别为对照组(Control)、HIBD组（HIBD)、PD-MSCs治疗组（HIBD+PD-MSCs)和成纤维细胞治疗组(HIBD+Fibroblasts)，各组大鼠在体重及性别方面无差异。在标准条件下由母鼠自由哺乳新生大鼠，于12小时光照-12小时黑暗交替条件下进行标准词养。所用动物房的室温控制在25.5±2.5°C,相对湿度保持在42%-72%。实验所用动物均自山东大学实验动物中心购买。本实验过程中，善待动物，对其处置过程中尽量减少痛苦，得到动物伦理委员会批准（山东大学齐鲁医院伦理委员会）。(二）主要试剂1.分离培养MSCs的主要试剂

(1)磷酸盐等渗缓冲离子溶液（Phosphate Buffered Saline, PBS)的配制：氯化钠 8.5 克、氯化钾 0.2 克、Na2HP04-12H205.531g，NaH2P04-2H200.8737g，双蒸水lOOOmL，在磁力搅拌作用下充分溶解后调节PH值为7.4。(2)细胞消化专用的0.25%胰蛋白酶的配制：先称取0.25克胰蛋白酶粉末，再量取lOOmLPBS缓冲液，充分地溶解2小时后，0.22微米滤膜过滤去除杂质和微生物，分装并于-20℃条件下储存以备用。(3)苏木素液的配制：先将2.5克明巩溶解于蒸馆水中，后将苏木素粉末2.5克加入到纯乙醇液体25ml中充分地溶解，再讲先前溶解了明巩的蒸馈水倒入苏木素乙醇溶液中充分地混勻，加热，慢慢地加入氧化萊1.25克，冷却后加入冰醋酸液体20ml，室温下保存。(4)伊红Y染色液：称取伊红粉末0.5-1.0g，取冰醋酸液体1-2滴，称取95%乙醇液体25ml，称取蒸馈水液体75inl。(5)4%多聚甲醛：先称取无水磷酸氢二钠粉末6.5克，然后称取憐酸二氢钠粉末4.0克，再量取40%甲醛溶液液体100ml，最后量取蒸馈水液体900ml。

结果

一、胎盘来源贴壁细胞形态观察将Wistar大鼠的胎盘组织碎块接种到培养瓶后，48小时即可见少量的原代细胞从组织块的边缘爬出，在第5天时可见较多的细胞贴壁生长，并且开始形成集落，贴壁细胞逐渐明显增多，部分呈克隆性增生，2周左右贴壁细胞即达到90%以上细胞融合，呈漩祸状、辖射状排列。第1-3代细胞的形态显著呈现多样化，在光镜下观察，以成纤维形细胞为多，也可见到其他形状的细胞：如圆形、多角形等，并且细胞体积大小不等。随着传代次数增多，成纤维形细胞逐渐为主，至第5代时，细胞形态、大小趋于相同（图 1.4.A，B)。二、胎盘来源贴壁细胞表型流式细胞仪检测结果：第4代胎盘来源贴壁细胞的细胞膜蛋白表述情况是：阳性表述细胞表型CD 29、CD 90、CD 44和CD 105，同时阴性表述CD 45(图1.4.C)。三、胎盘来源贴壁细胞多向分化潜能在向成骨细胞诱导分化的培养基中，成纤维状贴壁细胞逐渐地呈聚集状生长，在14 d后，光镜下，在大部分细胞的胞外基质中可以看见韩化表现，并且茜素红S染色是呈阳性的。在诱导向脂肪细胞分化Iw后，细胞形态幵始逐渐变宽变大，在21 d后，大约有50%的细胞内出现油红O染色阳性的脂肪颗粒（见图 1.5)。四、HIBD动物模型评价及细胞治疗效果观察(一）行为学观察实验前所有大鼠行为能力正常，活动自然，呼吸规律，离断左侧颈总动脉后置于缺氧箱中，缺氧开始时大鼠表现出躁动、窜动、呼吸变深变快、点头状颤抖，其后逐渐出现皮肤紫组，最后可出现倾倒、呼吸浅慢、抽搐、昏迷等表现。缺氧结束后，将大鼠在常规条件下饲养，可以观察到其中部分幼鼠可以出现吃奶减少，反应较为迟钝，可有左眼眼裂变小或左眼不挣，平衡感差，表现为动作的不协调甚至有向一侧旋转等表现（图1.6)。共造模150只大鼠，其中造模过程中有19只大鼠死亡（死亡率为12.67%)，造模后11只大鼠经Bederson评分为0分，故这些大鼠不列入研究对象。

第一部分：胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血性脑损伤模型中治疗效果观察前言................................... 15材料与方法...................................17结果...................................27讨论...................................31结论...................................41附图表...................................42参考文献...................................50第二部分：胎盘间充质干细胞有效治疗缺氧缺血性脑损伤作用机制的研究前言 ...................................60材料与方法...................................62结果...................................70

第二部分：胎盘间充质干细胞有效治疗缺氧缺血性脑损伤作用机制的研究

前言已有研究证明了 MSCs在缺血性疾病的治疗中取得了显著的效果，MSCs的多向分化潜能往往被认为起到了主要的作用，但近期的研究发现MSCs的旁分泌、免疫调节和促进血管再生发挥了更加重要的作用HIBD是一种多因素参与其中的复杂的病理生理过程，发病机制涉及炎症反应、氧化应激损伤、脑组织能量代谢的紊乱等多个环节。在本研究的第一部分中我们建立了大鼠HIBD模型，PD-MSCs治疗有效改善了模型鼠的生长发育及病理改变，因而在本部分中我们将继续深入探讨PD-MSCs的作用机制，分别从抗炎性反应和抗氧化应激机制两方面进行阐述。炎症反应是HIBD的一个重要的病理过程，免疫细胞在脑组织抗炎性反应和氧化应激损伤中发挥了重要的调节作用，其中CD4+辅助性T细胞是一类重要的免疫调节细胞，近年来，两类新的Th细胞亚群逐渐成为人们的研究热点，一类是辅助T细胞17 (T helper cell 17, Thl7)，介导细胞因子IL-17的表述上调，从而参与机体的炎症反应；另一类是调节性T细胞（regulatory T cells, Treg),目前认为它是由初始的CD4阳性T细胞在TGF-e因子的诱导处理下、并受到外来抗原刺激后分化而来，主要通过转录因子Foxp3参与维持机体的免疫平衡。IL-17既可直接导致脑组织的损伤，还可以诱导其他的淋巴细胞、巨唾细胞浸润以及增强小胶质细胞活性，促使下游炎性因子产生瀑布式释放，例如TNF-a的大量表述。Treg细胞则通过分泌IL-10，从而抑制下游炎性细胞因子如TNF-a、IFN-Y等的释放而发挥细胞保护作用[3]。由此可见，Thl7/Treg细胞是相互拮抗的，协调Thl7/Treg细胞功能维持在一个稳态水平，在各类免疫相关疾病的发生、发展都起到至关重要的作用。Li等[4]发现，不论在缺血性脑卒中大鼠脑梗死区域，还是不同时间点因脑梗死死亡病人脑组织中，缺血脑组织中IL-17mRNA的表述都明显升高。Gelderblom等[5]给予脑卒中小鼠IL-17 mAb封闭IL-17A的功能，减小了梗死面积。Liesz等在小鼠卒中模型中发现，运用CD25mAb对调节性T细胞进行措抗后，发现小鼠梗死面积增大，神经缺损功能加重。虽然Thl7细胞、Treg细胞参与了脑缺血后的炎性反应，但二者在HIBD中的研究甚少，因此，本研究对HIBD中Thl7/Treg细胞的失衡进行了研究，并且证实PD-MSCs治疗可能部分是通过纠正Thl7/Treg细胞失衡发挥作用的。

讨论

MSCs能够发挥组织修复能力主要通过分泌营养成分、趋化作用、免疫调节等方面。MSCs可以分泌大量具有生物活性的因子。Anmm等_发现MSCs移植后通过分泌大量的营养成分如细胞外基质糖蛋白、生长因子等促进组织的修复。同样Van等证实MSCs通过其营养分泌作用来促进损伤组织的重建。Wu等[22]将骨髓MSCs与原代软骨细胞共培养后，MSCs可以刺激软骨细胞增殖、基质的沉积，促进软骨细胞的形成。研究也表明MSCs能够促进血管生成和抑制炎性反应。另有研究发现MSCs通过其表面表述丰富的趋化因子受体起到修复作用，Von等[25]的研究指出MSCs上趋化因子受体CCR1、4、7、10高表述，因而在各种炎症因子刺激和趋化下，MSCs能够快速到达受损的组织局部，促进组织修复。Ries等的研究也表明，MSCs能够优先到达受损的组织部位，促进伤口的愈合，加快组织重建。虽然对MSCs的治疗机制进行了大量的研究，但目前MSCs治疗缺血缺氧性脑损伤的具体机制仍不明确。本研究在证实PD-MSCs输注治疗HIBD是有效的基础上，本部分对其作用机制进行了深入的探讨，从减轻炎性反应、抗氧化应激两个方面对PD-MSCs的作用机制分别进行阐述。治疗机制一：PD-MSCs减轻炎性反应，发挥免疫调节作用另一方面，组织损伤后的免疫反应也受主动调控机制的严格控制以避免二次组织损伤[33]。在这种调控机制中，Treg细胞作为一类重要的免疫调节细胞，既可以在生理情况中维持机体自身免疫耐受，又在神经系统炎性疾病时阻止免疫系统的过度激活[34]。Treg细胞在缺血性损伤后即使含量很低但发挥了重要作用。虽然已对脑缺血缺氧后的炎性细胞、细胞因子展幵了研究，但参与其中的细胞类型及机制仍不明确。Thl7细胞是Par等最早在自身免疫性脑脊髓炎和关节炎动物模型中发现的，特异性产生IL-17，故命名为Thl7细胞。IL-17在许多的细胞中广泛存在，包括髓样细胞和内皮细胞，是强有力的促炎因子参与炎症及自身免疫反应等[39]。IL-17本身可导致脑组织损伤，并诱使其他淋巴细胞、巨哩细胞浸润以及小胶质细胞活性增强，促使下游炎性因子瀑布释放，如TNF-a、趋化因子等的表述，引发炎性细胞浸润和脑组织破坏[40]。有研究发现，脑缺血后，损伤的局部组织中的IL-17基因表述上调，进而可以直接诱导下游一些炎性因子(如IL-l、IL-6、IL-8和TNF-a)基因的过表述，从而导致继发局域性炎性反应，如果通过分子抑制剂，抑制IL-17基因的表述，从而间接减轻脑组织损伤Gelderblom等[42]研究发现给予脑缺血小鼠IL-17A的抗体，可以大大减轻脑损伤面积、改善神经功能。参考文献（略）