霉酚酸酯预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制

前言

由于人类生活条件、饮食方式及周围环境的改变，冠状动脉样硬化心脏病成为威胁人类生命的主要疾病之一。在我国发病率最高达108. 6/10万，并继续有上升趋势。WHO更新了关于全球疾病状况的评估报告，报告显示，在过去10年中，缺血性心脏病、卒中、慢性阻塞性肺疾病和下呼吸道感染是人类致死的四大主要疾病。临床上采取药物、介入治疗及手术治疗恢复冠状动脉的血液供应，减少对心肌的损害。但有时恢复冠状动脉血流后引起临床症状加重即为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemic reperfusion injury, MIRI )。MIRI 是指心肌急性缺血时，血流再恢复后，心肌组织损伤反而出现损伤加重的表现，甚至是不可逆的损伤。血管开放后由于大量的中性粒细胞黏附、聚集在再灌注区并跨出血管壁浸润心肌组织，并且激活大量补体，加上生成活性氧，加重心肌组织的损伤，可表现为心肌顿抑(myocardial stunning)、再灌注性心律失常（reperfiisionarrhythmias)和致死性再灌注心肌损伤[2]。心肌缺血再灌注损伤常见于冠心病病人溶栓、冠脉支架植入术及冠状动脉旁路移植术等，是围术期发生并发症的重要原因，使临床死亡率明显增加。其防治是摆在医务人员面前最艰巨、最困难的任务之一，已成为人类面临的重要公共卫生问题。心肌缺血再灌注损伤机制十分复杂，就其主要机制概述如下：、再灌注损伤的机制1、MIRI时氧自由基的影响所谓自由基(freeradical)，又称游离基[3],在体内氧化反应过程中形成的，存在形式多为过氧化氢(H202)、超氧化阴离子(02-)、氢氧自由基(OH)和过氧化自由基(R00)等。这些氧自由基粒子当量微小，未配对电子存在其核外，化学反应活性是相当强烈的。活性氧簇[4] (reactiveoxygen species, ROS)在细胞信号传导中具有重要作用，是各种生命活动必不可少的生物活性物质。在外界因素刺激下，ROS生成量快速增多，超高水平的ROS会对核酸、蛋Q分子产生氧化作用，引起细胞膜结构和功能障碍，将这种现象称为氧化应激(OxidativeStress)。氧化应激反应可造成细胞损伤。机体通过一系列抗氧化机制，维持ROS平衡，如一些小分子还原物质、过氧化氧酶(Catalase)、特别是超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)等酶类，可以清除细胞生成的ROS。氧自由基能损伤生物膜系统和造成细胞内氧化磷酸化障碍。常见的氧自由基见表1。在正常情况下，氧化应激可以控制免疫反应、调节受体信号和维持细胞功能，如果氧化应激过度就会促进炎症细胞和血管平滑肌的生长和迁移、细胞外基质被降解、并且促进内皮细胞的凋亡；氧化应激可以激活转录因子，可以使白细胞趋化，释放炎症因子，其本身亦可以激活各种酶类，促进前列腺素、血栓焼素、白三炼等一些炎性物质的释放；氧化应激可以促进黏附分子过量表述等途径损害内皮细胞。当心肌组织缺氧时，能量代谢失常，细胞色素氧化酶不能将氧还原成水，变成氧自由基。通过过氧化杀伤，来破坏细胞膜的结构，损伤线粒体，破坏溶酶体；氧自由基损坏粘合血管壁的物质，造成被破坏的血管发生渗漏[9]。由于缺血造成缺氧，心肌细胞的线粒体膜结构被破坏，使线粒体功能受损，能量生成明显减少；当再灌注时氧自由基产生过多而抗氧化剂的产生相对减少，使心肌细胞膜损害加重，心肌细胞内溢出大量离子，干扰控制心脏搏动的电流信号，可造成心律失常，严重时导致死亡。2、MIRI时内皮细胞受损这三种途径分别为：自分泌途径、内分泌途和旁分泌途径。血小板在生理现实时与血管内皮间不发生反应，不会聚集也不会生成血栓，血液在血管内正常流动[12]。因为内皮细胞受到刺激后分泌缩血管物质（内皮素等）增多，内皮源性舒张因子产生减少，并且血小板不断聚集等因素造成冠脉血流障碍使心肌受损；同时使免疫应答、免疫系统激活，就这样在趋化性细胞因子的作用下激活产生TOLL样受体[13]。由于内皮细胞膜受损中性粒细胞的聚集、粘附分子表述增加等产生产生毛细血管阻塞[14]，是无复流的重要因素。3、MIRI与中性粒细胞的关系中性粒细胞与血管内皮细胞之间的作用在生理现实时被抗炎因子所抑制。当心肌缺血时，细胞膜磷脂发生降解，释放出多种趋化性因子，并且中性粒细胞也被激活，释放出的细胞因子和炎症介质都会介导中性粒细胞聚集并粘附于缺血区域多型核中性粒细胞聚集于微血管产生机械阻塞导致无复流被激活的中性粒细胞粘附于血管内皮细胞，阻塞毛细血管，产生的炎症因子损伤心肌细胞。另一方面，在HRI后，中性粒细胞激活造成呼吸爆发，造成大量的氧自由基等毒性产物被释放，激活破坏性蛋白酶，导致血管通透性的改变使血管发生渗漏，中性粒细胞渗透、聚集到心肌细胞使损伤加重。

第一部分霉粉酸酯预处理对缺血再灌注大鼠心肌的保护作用

引言缺血性心肌病严重影响着人类的生命安全。治疗心肌缺血的前提是恢复缺血区的血流灌注，但再灌注过程中会继发多种心肌组织损伤。心肌缺血再灌注损伤已成为冠状动脉溶栓术、冠状动脉搭桥术及介入治疗中常见的严重的并发症，尽管不断的改进心肌保护方法，MIRI后的心肌细胞损伤不能避免。所以，对心肌缺血再灌注损伤的预防及保护是心血管疾病研究的重点。大鼠MIRI模型是研究MIRI的經典模型。本试验通过建立在体大鼠I/R模型，经灌胃给予MMF，观察MMF对I/R心肌梗死面积、心肌组织形态学变化的影响；检测心肌酶：肌酸激酶（C)、乳酸脱氢酶（LDH)的变化。研究MMF对大鼠MIRI的保护作用，为进一步探讨MMF在心血管领域临床新的应用提供依据。

1、材料与方法1.1实验动物健康雄性SD大鼠30只，体重（260±40) g,由辽宁医学院实验动物中心提供，动物的合格证号：SCX (辽）2009-0004。

1.4心肌缺血再灌注损伤模型的建立大鼠术前12 h禁食不禁饮，20%乌拉坦按0. 3ml/100g的剂量腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，颈部和胸部皮肤常规消毒备皮。颈部正中切口，钝性分离气管，用眼科剪刀，在气管上部剪一小口，插入接有人工呼吸机的插管，打开呼吸机（频率80次/分，潮气量1.5ml/100g)，四肢皮下插入针型电极记录心电图，并接入BL-420生物机能实验系统，持续记录心电图，主要以II导联为主。在胸骨左缘2、3助间钝性分离肌肉组织，剪开助骨，并于肋骨根部穿透肌肉结扎，将助骨向两侧拉开，暴露心脏，剔除心包。用圆饼镊子轻轻拨动心脏，于肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部1 mm处找到左冠状动脉，用5-0无创伤缝合线穿透过左冠状动脉，结扎左冠状动脉前降支，用一去掉一条的PE管包裹动脉，连同PE管一起结扎冠状动脉前降支，使PE管压迫动脉阻断血流。结扎后心电图显示ST-T抬高，放松后ST-T回落50%为造模成功标志。心电图显示心肌缺血后计时30分钟，沿PE管缺失处剪掉结扎线，恢复心肌血流，再灌90分钟。实验结束后腹主动脉取血，留上清，超低温冰箱中保存备用。

1.5实验分组及给药大鼠取回后适应性喂养3天，正常饮食。挑选体重（260±40) g雄性SD大鼠30只，随机分为以下三组：1:假手术组(sham group):开展手术时仅穿无创伤缝合线，但不结扎左冠状动脉前降支。2：心肌缺血再灌注损伤模型组（MI/R):结扎左冠状动脉前降支30分钟后，去掉结扎线，恢复血流90分钟。3：霉紛酸酯组(MMF):手术前5天，每天给予MMF20mg/g灌胃，过5天后处理同模型组。MMF不溶于水，使用时采用0.5%的梭甲基纤维素钠助溶。为排除羧甲基纤维素钠对实验结果的影响，本实验中假手术组和心肌缺血在灌注损伤模型组大鼠灌胃给予相应体积0.5%的豫甲基纤维素钠5天。

1.6实验方法1.6.1心肌梗死面积测定再灌注过程结束后，立即取出心脏，剪去心房和右心室心肌，用PBS液洗去残存的血液，把处置好的心肌放入冰箱，设置-20℃存放15分钟，这时心肌组织稍硬，取出心脏，用刀片在冠脉结扎线下平行于冠状沟将心室等厚切成5片，放入预先配好的0.5% NBT溶液中，于37°C恒温水浴染色，坏死区因无脱氢酶而不着色，未坏死区染成深蓝色，当观察到为坏死区心肌组织变成深蓝色时终止染色，用PBS冲洗残存染色液，拍照，分析。梗死区面积%=梗死区面积/整个心脏的面积。1.6.2 HE染色观察心肌组织形态学变化1)灌流结束后取心室部位PBS冲洗后放入4%的多聚甲酸中固定24小时2)梯度酒精脱水：70%酒精8小时一80%酒精8小时一90%酒精2小时一95%酒精1小时两次一无水乙醇两次各两小时3)二甲苯透明：二甲苯115分钟（观察边缘透明），二甲苯II15分钟4)侵蜡：烘箱调至60度，使蜡融化，将组织导入呈有液体蜡的烧杯中30分钟，二遍侵蜡30分钟，将组织放入到自制的蜡盒中，倒入新鲜的液蜡，室温使錯固定

第二部分霉酚酸酯预处理对缺血再灌注心肌凋亡的影响材料和方法......................................31结果......................................39讨论......................................41附图......................................43第三部分霉酚酸酯预处理对缺血再灌注心肌炎症反应及炎症信号通路的影响材料和方法......................................46结果......................................54讨论......................................56附图......................................59全文总结......................................61

第二部分霉酚酸酯预处理对缺血再灌注心肌调亡的影响

细胞调亡，也称细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD)是在生理或病理条件下由基因控制的通过激活内源性核酸内切酶引起的细胞死亡过程。自1972年err等首次提出细胞凋亡的概念以来，人们逐渐认识到凋亡的本质及货在医学领域的重大意义。细胞凋亡以细胞皱缩、核固缩、膜泡状化、调亡小体形成、染色体致密及DNA片段化为特征。细胞凋亡与坏死完全不同，细胞调亡是一个耗能性、主动的自杀过程。在正常组织和器官的发育及多种疾病的发生过程中细胞凋亡起着重要作用，因此，细胞凋亡是个体发育成熟稳重和维持正常过程不可缺少的，如果细胞调亡的规律失常，将会导致各种疾病的发生。近年来，随着分子生物学技术的不断丰富及分子心血管病学的研究发展，对心肌细胞凋亡各方面的研究已经展开，认识到调亡在心脏正常生理和病理情况下发挥重要作用。Matoba研究表明，凋亡是心肌缺血、缺氧及再灌注损伤细胞死亡的一种主要形式，因此研究细胞调亡对阐述心肌缺血再灌注损伤的发生具有重要意义。我们的前述研究已经证实，MMF预处理对心脏缺血再灌注损伤有有保护作用，本实验利用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，研究MMF对心肌细胞调亡的影响及其机制。采用20%的乌拉坦，以1g/g的剂量给予麻醉，固定实验动物，颈部及胸部备皮，提拉颈部皮肤并剪开，分离气管，V型剪开气管，行气管插管，连接动物呼吸机；打开呼吸机（频率80次/分，潮气量1.5 ml/lOOg)，记录心电图，并接入BL-420生物机能实验系统，持续记录心电图，主要以II导联为主。在胸骨左缘2、3助间钝性分离肌肉组织，剪开肋骨，并于助骨根部穿透肌肉结扎，将肋骨向两侧拉开，暴露心脏，剔除心包。用圆饼镊子轻轻拨动心脏，于肺动脉圆锥和左心耳之间距主动脉根部1 mm处找到左冠状动脉，用5-0无创伤缝合线穿透过左冠状动脉，结扎左冠状动脉前降支，用一去掉一条的PE管包裹动脉，连同PE管一起结扎冠状动脉前降支，使PE管压迫动脉阻断血流。结扎后心电图显示ST-T抬髙，放松后ST-T回落50%为造模成功标志。心电图显示心肌缺血后计时30分钟，沿PE管缺失处剪掉结扎线，恢复心肌血流，再灌90分钟。

第三部分蹇細靡预缺血再灌注心肌炎症反应及炎症信号通路的影响

讨论首先，心肌缺血再灌注损伤时也激活的中性粒细胞合成释放肿瘤坏死因子、IL- IL-6等炎症介质，介导其他炎症细胞共同攻击心肌组织。Yang等[7i]研究表发现RAG1-/-小鼠和对照组均阻断左冠状动脉前降支后的心肌梗死面积比较，RAG1-/-小鼠的梗死面积明显缩小；而重组RAG1-/-小鼠转入CD4+T细胞后心肌梗死面比RAG1-/-小鼠明显增大；试验表明T细胞缺陷影响缺血再灌注心肌梗死面积，研究显示CD4+缺陷小鼠比对照组的心肌梗死面积显著降低，进一步显示CD4+T细胞在MIRI中有损伤心肌细胞作用。上述试验证明了CD4+T细胞加重心肌再灌注损伤。在Toll样受体家族(TolWie receptors, TLRs)中，TLR4的是内源性免疫受体，在心肌缺血再灌注损伤时，大量活性氧自由基的产生及中性粒细胞的浸润中TLR-4可能发挥作用。多数研究采用了相关通路基因缺陷的动物或TLR4敲除技术，观察到在心肌缺血再灌注损伤过程中TLR4是导致心肌损伤和炎症反应的关键受体。动物试验表明，预先给予动物TLR4的受体阻断剂Eritoran，可以显著降低局灶性心肌IR后心肌梗死面积;与对照组比较，Eritoran组动物心脏憐酸化、NF出表述也明显降低[72]。Chong等[73]制备心肌缺血再灌注损伤模型分别采用野生型小鼠(C3H/HeN)与TLR-4基因突变小鼠(C3H/Hej),试验表明，IN的激活受阻，抑制了 NF-B的活性，显著降低了炎症级联反应C3H/Hej小鼠心肌梗死面积显著下降。另有研究表明,TLR-4能够调节在心肌缺血再灌注损伤的炎症反,能够激活下游细胞因子，TLR4介导的炎症反应在MIRI过程中起了重要作用。这说明在心肌缺血再灌注中抑制TLR4可以保护作用的心肌。

全文总结一、在成功复制大鼠缺血再灌注损伤模型的基础上，本研究首先证实霉酚酸酯预处理有保护作用。二、本研究从细胞凋亡的角度进一步证实酸醋对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。三、本研究从炎症及信号转导通路研究方面，对其作用机制进一步阐述，本研究证实，霉酚酸酯的预处理可以明显抑制炎症因子TNF-a的含量，该作用可能是通过TLR4/NF-Bp65信号通路介导的。四、本研究将为霉酚酸酯在心血管保护领域的进一步应用提供理论依据。

参考文献（略）