人膝骨关节炎滑液蛋白质组学研究及国人骨关节炎流行病学Meta分析

第一章同位素标记结合RPLC-MS构建人膝骨关节炎关节滑液差异表述蛋白质谱

引言早期骨关节炎发病的症状通常较轻，膝关节为最常累计的部位，在临床上发病时通常已经属于症状较重的时期即中晚期，晚期患者往往只能通过关节置换手术治疗，给患者和家属带来了巨大的精神和经济负担。因此，骨关节炎防治过程中早期诊断、治疗效果监测和预后评价发挥了不可替代的重要价值。当前，诊断骨关节炎的方式仍然依赖于临床症状和X线影像学诊断，-L分级仍为判断骨关节炎严重程度、预后评估和治疗模式指导的主要参考。与类风湿性关节炎不同，骨关节炎缺乏特定和特有的分子标志物，而分子标志物在临床上可以作为诊疗疾病的最直观的显示，所以探索骨关节炎新的分子标志物和药物勒点将为骨关节炎的早期防治工作带来极大的便利。骨关节炎的发生是一个多因素参与的慢性进行性过程，其功能和形态的改变直接由蛋白质的表述和修饰所决定。因此要了解不同病程所表述的蛋白质，就必须深入研究骨关节炎患者血清、关节滑液、关节软骨、滑膜和尿液等与正常人的差异蛋白质作为紀点和生物标记物正是目前研究的热点，伴随着人类基因组计划的完成，科学界开始大力发展后基因组，因此蛋白质组学技术必将成为多蛋白调控的骨关节炎研究最有力的工具，比针对单一蛋白分子的研究更加可靠和符合人类复杂的生理环境。本研究首先用透明质酸酶去除关节滑液中的透明质酸，降低點性，然后采用1D-SDS-PAGE预先分离滑液样本总蛋白，利用稳定的180同位素标记技术，结合反相液相色谱和质谱技术获得并鉴定骨关节炎相关差异蛋白。

材料与方法按随机原则选取膝关节骨关节炎患者，骨关节炎患者均采用AmericanCollege of Rheumatology (美国风湿病协会）对于膝关节骨关节炎的诊断标准进行诊断后选取。分级采用ellgren-Lawrence (-L)分级的放射学标准5级（-L分级见表1-1)分级法,随机选取-L分级4级患者膝关节的9例膝关节滑液，患者的基本信息见表1-2，典型的患者膝关节正侧位X线片见图1-1。以同期外伤后截肢收检的9例健康、无骨关节炎的膝关节关节滑液作为对照组。无菌条件下抽取病例组和对照组的膝关节关节滑液，立即将滑液用透明质酸酶进行酶解，去除滑液中的透明质酸，降低滑液的黏度。置于-80℃冰箱保存，用于RPLC-MS蛋白质组分析从正常和骨关节炎患者关节滑液中获取的总蛋白在相同的试验条件和参数设置的情况下进行1D-SDS-PAGE预分离，重复三次，得到背景清晰、分辨率高、重复性好的凝胶图像（如图1-5)。按照凝胶上两组样本相对应的条带，配对样品（正常与骨关节炎）的电泳分离胶平行切割，分别切成30个条带。随着大量生物体全基因组序列的获得，以及基因多态性的相关研究，人们发现仅仅从基因序列的角度研究生物的功能根本无法获得完整的结果。由于蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者，在疾病的发生发展过程中，基因的作用更多地依靠后基因组，即基因的表述，表述产物的修饰和蛋白之间的相互作用来完成，所以蛋白质组学的研究受到人们越来越多的关注。蛋白质在疾病中的重要作用相比于基因更直接和直观，使得蛋白质组学研究在人类疾病的研究中有着极为重要的价值，目前已被广泛应用于各种疾病的研究。本研究在骨关节炎患者和正常人膝关节关节滑液之间总共鉴定出38种差异蛋白。对于这些蛋白的结构和功能仍需要将来进一步的全面的鉴定。从这方面可以看出，本研究针对差异蛋白的功能方面研究并不充分，也是本研究的一点不足之处和下一步研究的方向。ID-SDS-PAGE是利用蛋白质分子量的不同而在胶内蛋白分离的一种方法，聚丙稀酰胺（PAGE)凝胶是网状结构，属于一种分子蹄的原理。十二烧基磺酸钠（SDS)是一种阴离子去污剂，能断裂分子间和分子内的氧键，是蛋白质的三级结构失去。蛋白质亚基在胶内的电泳迁移率主要取决于分子量的大小。因此1D-SDS-PAGE不仅可以分离总蛋白，而且通过特殊的Marer可以大致推测蛋白质条带的分子量。最初的实验设计并未设计1D-SDS-PAGE预分离，但是遇到了一个问题，质谱分析有一个特点，即高丰度蛋白常掩盖低丰度蛋白的峰值，如果总蛋白样本中同时含有两种类型的蛋白，则始终只能检测到高丰度蛋白的肽段。因此，在最初的滑液样本进行质谱分析后，由于高丰度蛋白如白蛋白和IgG的出现，无法鉴定出真正的差异蛋白。因此，采用1D-SDS-PAGE将总蛋白通过电泳后，总蛋白即分离开，从染色后的胶块上可看出高丰度蛋白的位置，在切胶时尽量避免切取该部分胶条，可最大程度上去除高丰度蛋白，更容易检测出差异蛋白。

第二章人骨关节炎关节滑液差异蛋白的生物信息学分析

引言生物信息学是蛋白质组学分析阶段的核心技术，主要包含了生物信息的获取、处理、存储、分发、分析和解释等各个方面，通过综合运用计算机科学、数学和生物学的各种工具来理解和阐明各种蛋白质组技术数据所包含的生物学意义生物信息学在蛋白质组学相关研究领域的应用主要有四个方面:1、获取与分析双向凝胶电泳图谱；2、基于生物信息学的蛋白质鉴定；3、蛋白质组数据库的构建；4、对蛋白质的理化性质、结构、功能等信息进行预测。本研究旨在对蛋白质的功能网络等信息进行预测，并构建膝骨关节炎的关节滑液蛋白质组数据库。

软件与方法根据对细胞组分的GO分析，差异蛋白中血装脂蛋白颗粒比重最大，占35%，其次为极低密度脂蛋白，占22%。根据对分子功能的GO分析，差异蛋白中serine-type肽链内切酶抑制剂和酶抑制剂活性较强，分别占15%和14%。根据对生物过程的GO分析，差异蛋白中以急性期炎症反应和创伤后应激反应为主。本研究对RPLC-MS获取到的差异蛋白进行生物信息学分析，根据对细胞组分的GO分析，差异蛋白中血衆脂蛋白颗粒比重最大，占35%，其次为极低密度脂蛋白，占22%，提示滑液中的脂蛋白在骨关节炎发病中起到一定的作用。根据对分子功能的GO分析，差异蛋白中serine-type肽链内切酶抑制剂和酶抑制剂活性较强，分别占15%和14%，提示差异蛋白中以酶抑制剂为主。根据对生物过程的GO分析，差异蛋白中以急性期炎症反应和创伤后应激反应为主，提示骨关节炎可能与局部炎症反应关于。

1、生物信息学技术可用于差异蛋白的功能预测和相互作用网络分析，为骨关节炎生物标志物研究提供了一定的方向和依据。

2、骨关节炎滑液中差异蛋白以酶抑制剂为主，脂蛋白及局部炎症反应在骨关节炎发病中发挥一定作用。

第二章人骨关节炎关节滑液差异蛋白的生物信息学分析.......36引言.........................361软件与方法.........................361.1软件或数据库.........................361.2 方法.........................36第三章国人骨关节炎流行病学Meta分析.......52引言.........................521资料与方法.........................521.1文献检索.........................521.2文献纳入和排除标准.........................53全文总结................................72

第三章国人骨关节炎流行病学Meta分析

引言骨关节炎是一种多因素影响的疾病，包括性别、年龄、基因和环境因素的影响。许多疾病被证实和骨关节炎密切相关:肥胖、关节和铺带损伤、初带退变和不稳定、关节的先天性紊乱、糖尿病、炎症性疾病（如Perthes病）、所有的慢性关节病变（如痛风和类风湿性关节炎）、Marfan综合征，以及败血症性关节炎等。在过去的数十年里，对于骨关节炎的流行病学调查提示骨关节炎的患病率在研究间差异较大，但总体均呈增长趋势。有研究证实，退行性关节病和退行性关节炎对临床患者的生活质量及预后影响较大，因此对骨关节炎的研究尤为重要。

全世界范围内的研究估计大约10%的男性、18%的女性和60-65%的60岁以上的均患有症状性骨关节炎，并且80%的此类患者有活动的受限。该研究指出，骨关节炎的主要特点是关节软骨的进行性缺失和骨赘的形成，这些将导致关节疼痛、畸形和病人的功能障碍。骨关节炎的治疗目标是减少和控制患者的疼痛，改善物理功能，预防功能障碍，以及提高生活质量。有研究发现骨关节炎与关节的畸形有独立的相关性。另有研究报道，骨关节炎与骨质疏松症关于，作者提出假设认为骨密度的降低可能是骨关节炎的另一个重要因素。随着中国经济的快速发展、营养水平的提高以及医疗水平的改善，居民的平均寿命得到延长且逐渐步入老龄化社会；因此对于慢性病的预防和控制变得更加重要。骨关节炎作为一种慢性病，给社会带来了诸如残疾、活动障碍和疼痛的社会问题，更增加了医疗和护理的负担。所以，研究和明确骨关节炎的蛋白质组学规律，对于指导临床诊断和预后估计有不可替代的意义。为了适应分析需求并减少误差，纳入的研究均满足以下标准：1、病例的收集基于实地考察；2、研究基于人群样本而非志愿者；3、有明确的诊断标准和样本信息；4、如果有多个研究基于同一群体，只纳入报道最详细数据的研究。所有纳入的文献均采用同一诊断标准。如果不能从文献和作者处获取必需的足够信息，如样本量和患病率，则排除该文献。

全文总结

骨关节炎是常见的慢性关节退行性疾病之一，患病率较高，由于缺乏早期诊断以及监测该病发展过程的特异性生物标记物或药物範点。大多数骨关节炎患者在确诊时已经处于中晚期，需要接受关节置换手术，给患者造成了一定的压力。因此，寻找新的骨关节炎分子标志物是骨关节炎诊治中亟待解决的关键问题。骨关节炎滑液和同一部位的正常滑液的比较蛋白质组学技术是发现骨关节炎相关蛋白和分子标记物最有效和最直接的方法之一。但仍面临不同患者样本的异质性以及难以准确定量等问题，需要进一步的实验研究来证实。针对蹄检到的差异蛋白，进行生物信息学分析发现，根据对细胞组分的GO分析，差异蛋白中血装脂蛋白颗粒比重最大，占35%，其次为极低密度脂蛋白，占22%，提示滑液中的脂蛋白在骨关节炎发病中起到一定的作用。根据对分子功能的GO分析，差异蛋白中serine-type肽链内切酶抑制剂和酶抑制剂活性较强，分别占15%和14%，提示差异蛋白中以酶抑制剂为主。根据对生物过程的GO分析，差异蛋白中以急性期炎症反应和创伤后应激反应为主，提示骨关节炎可能与局部炎症反应关于。通过差异蛋白的STRING分析可知，除了少数功能相对独立的蛋白外，大多数蛋白在发挥功能中有协同作用或其他相互作用。对于骨关节炎在中国人群中的患病率，通过检索查阅相关文献，得出了如下结论：在中国骨关节炎的患病率与性别、年龄和地域分布关于，女性患病率均高于男性，膝关节骨关节炎的患病率在男性65岁、女性55岁为发病风险年龄，且呈现东部和北部高于西部和南部的特征。