血清外泌体分离鉴定及其内含物与帕金森病关联研究

前言

最近，有研究证实外泌体中含有的信使RNA (mRNA)、microRNA、蛋白质和信号复合物在受体细胞基因和蛋白表述调控中有重要作用[17]，其中有在所有外泌体均表述的标记蛋白包括膜运输和融合蛋白（RabGTPases、flotillin和膜联蛋白）、多泡体合成相关蛋白（Alix和TSG101) [21]、整合素、跨膜四蛋白超家族（CD9、CD63、CD81 和 CD82) [22, 23]和热休克蛋白（HSP70、HSP90)等[24, 25]；还有细胞特异性蛋白，和分泌外泌体的细胞来源相关，如抗原提呈细胞释放的外泌体含有主要组织相容性复合体（MHC) [9]、少突胶质细胞来源的外泌体含有髓鞘蛋白[13]。外泌体存在的多种类型内含物，都可以作为疾病诊断和检测的生物标志物，实现相关的分子IE向治疗，同时有研究证实外泌体是细胞间交流的特殊媒介[26, 27]。因此无论在体内功能理论研究方面，还是在临床应用实践研究方面，针对外泌体分离鉴定相关的研究都是该领域进一步探索的重要基础之一。外泌体（Exosomes)来源于晚期胞内体（也称为多泡体multivesicular bodies，MVBs),在细胞内吞系统中形成、分泌和释放，不同于一般的调亡小体，此内吞系统主要包括原始胞内小泡、早期胞内体和多泡体[28]。如图1所示，活细胞通过胞内吞途径将原始胞内小泡等内吞物质转变成内吞小体，融合为早期胞内体；在早期胞内体成熟稳重过程中，管腔内囊泡（intraluminal vesicles, ILVs)中的内含物和表面分子构成发生很大变化，蛋白和信号复合物聚集在多泡体内界膜上，通过多泡体膜内陷选择性地与ILVs融合[29, 30]。多泡体内的小囊泡可以有三种去向：（1)和溶酶体融合，管腔内囊泡及其内容物被水解消化；（2)接受病理性刺激后，多泡体中的小囊泡和细胞膜融合从而使其内容物表述于细胞膜表面，如与细胞膜融合后，B细胞和未成熟稳重DC细胞内的MHC II类分子可表述于细胞膜表面[31]; (3)多泡体也能和衆膜（plasma membrane)融合从而释放管腔内囊泡，一旦其进入细胞外环境中被称为外泌体[28]。

尽管近年来对外泌体合成分泌途径的研究已较为透彻，但其过程中涉及的致病分子机制和内含物的功能研究才刚开始被揭示。有研究发现，这些囊泡结构在神经发育和再生、皮质和海马神经元突触可塑性方面都有重要的功能作用[33，34],而且在病理刺激或损失情况下，他们也表现出免疫刺激特性从而活化和传播炎症反应[5，14]C事实上现已明确炎症反应在帕金森病发病机制中有重要作用，其能够加速疾病中黑质的神经退行性改变[35]。最近，针对外泌体如何致病的过程进行了大量研究，包括大脑致病性蛋白的传递和帕金森病在内的不同神经退行性疾病的病程发展[36]。a-突触核蛋白分泌后在脑脊液[37]、血楽[38]和细胞培养液[39]中均能检测到，表明a-突触核蛋白能够在细胞间传递。Emmanouilidou等[40]于2021年首次发现神经母细胞瘤细胞产生的a-突触核蛋白的单体和聚合物通过外泌体、韩依赖机制分泌到胞外，引起神经元受体细胞死亡，表明外泌体分泌的a-突触核蛋白可能是帕金森病神经退行性变的媒介。随后Alvarez[41]等人也发现了类似现象，发现培养的SH-SY5Y细胞系通过胞外分泌的外泌体途径释放a-突触核蛋白，这一研究结果强调了外泌体在a-突触核蛋白细胞间转运中的作用，进一步增强了外泌体与帕金森病的相关性，包括a-突触核蛋白聚积和溶酶体功能紊乱等。尽管大量实验发现了外泌体在正常人群和疾病患者体液中的表述[46]，目前尚未关于于帕金森病患者的外周血清中外泌体的相关研究。以往研究发现a-突触核蛋白存在于血清中，SH-SY5Y细胞系分泌的外泌体中也含有a-突触核蛋白，目前尚未关于于帕金森病患者的血清外泌体中是否存在a-突触核蛋白的相关报道。因此，本研究旨在首次探讨帕金森病患者血清中是否存在外泌体，进一步验证在帕金森病患者外泌体中是否表述帕金森病相关蛋白质，与正常人表述是否存在差异，从而利用外泌体为帕金森病的早期诊断和勒向治疗提供理论依据。

1血清外泌体的分离和鉴定

外泌体的鉴定依赖于形态学观察和蛋白质分析。形态学观察和鉴定主要是依赖电镜，其直径大小在30-100nm之间，电镜下负染色后呈杯口状或圆形囊泡结构[6-8]。外泌体中含有的信使RNA (mRNA)、microRNA、蛋白质和信号复合物在受体细胞基因和蛋白表述调控中有重要作用，其中有在所有外泌体均表述的标记蛋白包括膜运输和融合蛋白（Rab GTPases、flotillin和膜联蛋白）、多泡体合成相关蛋白（Alix和TSG101) [21]、整合素、跨膜四蛋白超家族（CD9、CD63、CD81 和 CD82) [23, 24]和热休克蛋白（HSP70、HSP90)等[21，25];还有细胞特异性蛋白，和分泌外泌体的细胞来源相关，如抗原提呈细胞释放的外泌体含有主要组织相容性复合体（MHC) [9]、少突胶质细胞来源的外泌体含有髓鞘蛋白[13]。

1.1研究对象20例散发性帕金森病患者来自2021年6月至2021年12月中南大学湘雅医院神经内科门诊病人，平均年龄63.79±9.58岁，男性13例，女性7例，均为中国汉族人。所有病人均经过两位运动障碍疾病专科医师的详细神经系统检查。散发性帕金森病诊断参照英国帕金森病脑库诊断标准[53],临床分期参照HY分类方法[54]，临床表现具有运动迟缓的表现，并至少具有下列症状之一：肌强直、静止性震颤和姿势不稳；对多巴制剂反应好；排除家族史：家族史阳性的标准是与患者有血缘关系的一级和二级亲属中有PD患者；排除继发性帕金森病综合征：既往无脑炎、脑血管病、头部外伤、中毒、服用抗精神病药物史。20例正常对照者来自中南大学湘雅医院体检中心的体检人群，对照组平均年龄62.71±10.13岁，男性13例，女性7例。无重大器官功能障碍、神经系统疾病以及有运动障碍疾病等神经系统疾病家族史。随机抽取其中4例患者和4例年龄性别匹配的健康对照者纳入血清外泌体分离鉴定研究。

1.2主要仪器与试剂加入TEMED后将上述液体立即摇勻即可灌胶。灌胶时，可用1ml移液枪吸取1ml胶迅速加入制胶槽的两玻璃板之间至适当高度，灌胶时要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生，用去离子水液封，室温下放置30-45分钟，待分离胶聚合后制备浓缩胶；(1)待浓缩胶聚合后，两手分别捏住齿梳两端竖直向上小心将其拔出，用去离子水冲洗加样孔，除去残留的浓缩胶，然后将玻璃板对齐装入电泳槽内，在内外电泳槽中加入足量IX电泳缓冲液，确保凝胶的最上端和底部都浸入电泳缓冲液中；(2)取已经测定蛋白浓度的样品30ug，在总蛋白内加入等体积2XSDSloading buffer。在95°C加热变性5分钟，将变性的样品在台式离心机上瞬时离心后将蛋白样品及蛋白marer加入10% SDS-PAGE胶的上样孔内，为使胶跑的比较平整，在胶的最左右两边两个点样孔内加入2XSDS loading buffer。以90V恒压电泳30分钟，待进入分离胶后再转为120V恒压电泳60分钟，至溴酸蓝指示剂的蓝色条带跑至距胶底l-2cm时停止电泳。(1)电泳完毕，将玻璃板从电泳槽中取出，卸下玻璃板，取出凝胶，用刀片将多余的部分切去；(2)根据凝胶大小剪一张PVDF膜和两张滤纸板，PVDF膜在使用前需要无水甲醇浸泡2分钟，然后在IX转膜液中漂洗5秒，海绵和滤纸都要在IX转膜液中浸泡5分钟；(3)在转膜夹打开，黑面上方依次将海绵、滤纸板、凝胶、PVDF膜、滤纸板、海绵置于其上，赶去气泡后将转膜夹夹好固定于转膜槽中，将转膜槽周围加满冰，并使膜靠近电极阳面，以220mA恒流转膜90分钟；(4)转膜过程中换一次冰盒，转膜完毕后将膜从转膜夹中取出，膜上转有蛋白Marer的一面做好标记，可于脱色摇床上摇、用1%丽春红染色液染约5分钟，蛋白条带应在PVDF膜上显示清楚，用IxTBST液冲洗2-5分钟直至染色条带消失。血液标本较培养基标本更粘稠、密度更大。本研究工作表明，传统的差异离心法提取外泌体步骤繁琐、耗时长、易污染、产量低不适宜进行大量生产；ExoQuic试剂法是利用外泌体的特异性提取，根据免疫共沉淀原理进行，操作简便，能够获得高纯度的外泌体样本，是比传统差异离心较为新兴的提取方法。因此，本研究选择ExoQuic试剂法进行分离提取外泌体。

前言..............................11血清外泌体的分离和鉴定.................41.1研究对象.................51.2主要仪器与试剂.................51.2.1 主要仪器.................51.2.2主要试剂、耗材.................61.2.3主要试剂的配制.................71.3实验方法.................112血清外泌体中帕金森病相关蛋白的检测.................242.1研究对象.................252.2主要仪器和试剂.................252.2.1主要仪器.................25

2血清外泌体中帕金森病相关蛋白的检测

血清作为一种最有吸引力的体液之一，通过临床蛋白质组学研究可能具有迅速在临床实用化的潜力。在血液的固相成分中，外泌体近年来受到普遍关注，外泌体是许多活细胞晚期内体形成并分泌到细胞外的一种膜性小囊泡，主要是由蛋白质和脂质组成，不同细胞来源的外泌体所含的蛋白质不同，其生物学功能也是有差异的。目前通过Western blot和流式细胞术（FACS)分析了不同活细胞来源的外泌体，发现所含的蛋白质是有区别的，外泌体中某些特异性蛋白质与其来源细胞密切相关，这些特异性蛋白质可能参与其来源细胞的某些重要生理过程。如上所述，以往研究发现a-突触核蛋白存在于血清中，而SH-SY5Y细胞系分泌的外泌体中也含有a-突触核蛋白，目前尚没关于于帕金森病患者的血清外泌体中是否存在a-突触核蛋白的相关报道。在第一部分实验研究中，我们首次证实在帕金森病患者血清中存在外泌体，直径在30-100mn之间的类圆形囊泡膜结构，含有CD63等管家蛋白，该囊泡的蛋白成分、形态和大小均与文献中报道的外泌体特征一致[7]。本部分的研究拟在此工作基础上，进一步探讨帕金森病人的外泌体中是否有异常表述的帕金森病相关蛋白，探讨其与帕金森病发病的相关性，为寻求早期诊断和IE向治疗提供理论依据。

2.1研究对象20例散发性帕金森病患者来自2021年6月至2021年12月中南大学湘雅医院神经内科门诊病人，平均年龄63.79 土 9.58岁，男性13例，女性7例，均为中国汉族人。所有病人均经过两位运动障碍疾病专科医师的详细神经系统检査。散发性帕金森病诊断参照英国帕金森病脑库诊断标准[53],临床分期参照HY分类方法[54]，临床表现具有运动迟缓的表现，并至少具有下列症状之一：肌强直、静止性震颤和姿势不稳；对多巴制剂反应好；排除家族史：家族史阳性的标准是与患者有血缘关系的一级和二级亲属中有PD患者；排除继发性帕金森病综合征：既往无脑炎、脑血管病、头部外伤、中毒、服用抗精神病药物史。20例正常对照者来自中南大学湘雅医院体检中心的体检人群，对照组平均年龄62.71 土 10.13岁，男性13例，女性7例。无重大器官功能障碍、神经系统疾病以及有运动障碍疾病等神经系统疾病家族史。所有20例患者和20例对照均纳入外泌体中帕金森病相关蛋白表述的研究。

2.6结论在体内研究方面，Gonzales等于2009年在正常人尿液中也检测到外泌体，其中含有LRR2、D-1等帕金森病相关蛋白[79]，随后研究发现帕金森病患者尿液中外泌体内LRR2表述水平较年龄性别配对的正常者升高，这种表述受抑制剂14-3-3调控[80]。本实验研究对象中未检测到LRR2蛋白，表明帕金森病患者外周血清外泌体中可能不表述LRR2蛋白，目前原因未知，可能与其本身在外周血中低表述关于，需要进一步的扩大样本量和后续的功能研究去证实。本研究首次探索并证实帕金森病患者外周血清中存在外泌体，也证明其可表述帕金森病相关蛋白a-突触核蛋白，且较正常对照组含量显著减少（P<0.05)，原因可能存在以下方面：1.可能a-突触核蛋白在帕金森病患者体内形成路易氏小体，其在外周血外泌体中的表述相对减少；2.帕金森病患者本身分泌外泌体能力下降，检测到的a-突触核蛋白的含量相对减少；3.本次试验样本量少，需要进一步扩大样本量验证；4.检测手段过于单一，本研究只使用了 western blot检测蛋白表述，需要多种方法结合验证等。总之，帕金森病患者外周血清外泌体中检测到a-突触核蛋白的表述，有助于帕金森病的早期诊断和IE向治疗，为帕金森病患者外泌体的进一步研究打下坚实的基础，但对于实验的敏感性和特异性尚有待更大样本量研究的验证。如需进一步研究外泌体的蛋白质组学，还要对外泌体行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析（MALDI-TOF-MS)和大规模样本量验证。将外泌体最终应用于疾病的早期诊断和临床治疗还有漫长的路程，需要对外泌体的蛋白质组成进行更为详尽的基础研究，并且需明确外泌体在帕金森病模型中的具体致病效应及其机制。

参考文献（略）