间皮素在卵巢上皮癌中的诊断价值及负载间皮素基因的DC疫苗抗卵巢癌

引 言

临床Ⅲ期患者 5 年生存率为20-30%，Ⅳ期患者 5 年生存率不足 5%[4]。绝大多数晚期病人经过卵巢癌肿瘤细胞减灭术及紫杉醇和铂类联合化疗后均在一段时期内得到缓解，但在经历了几个周期的缓解-复发后，最终出现化疗抵抗而导致死亡[5，6]。因此，寻找敏感的早期诊断筛查指标、寻找特异有效的治疗方法是提高卵巢癌患者 5 年生存率的关键环节。可溶性间皮素相关蛋白(Soluble mesothelin related protein，SMRP)是相对分子质量为 42-45Da 的蛋白质，其氨基末端的氨基酸序列与膜结合间皮素相同，1999 年，Scholler 等[11]最早在卵巢癌患者血清中检测到该抗原,之后在其他肿瘤患者血清中也得到同样发现，提示 SMRP 可以用于有间皮素表述的恶性肿瘤的诊断。间皮素的生物学功能尚不明确。有研究表明其与CA125 有很高的亲和力，二者共同作用，参与细胞粘附，并且与肿瘤的腹腔种植转移关于[12-14]。最近的研究表明间皮素在肿瘤细胞生存、迁移、入侵和肿瘤进展方面起着重要作用[15-18]。正是间皮素这种特异性表述使它成为理想的肿瘤免疫治疗的靶点。国内外针对间皮素的卵巢癌肿瘤疫苗的研究多集中于 DNA 疫苗和抗与众不同型抗体疫苗方面[19-23]。树突状细胞（Dendritic Cell, DC）是高度专职化的体内最强的抗原递呈细胞，在诱导针对肿瘤相关抗原（TAA）的高效、特异的T细胞免疫应答过程中起着关键性作用[24]。人们采用多种抗原加载技术，包括病毒、细菌、酵母细胞载体感染DC，蛋白或肽修饰DC，DNA、RNA转染DC等，研究出多种DC疫苗[25]。近年来诸多研究围绕着卵巢癌的DC疫苗展开。体外实验[26，27]已充分证实DC疫苗在卵巢癌免疫治疗中是有效的。Hernando等[28]将特异性叶酸受体alpha的mRNA转染DC，分10次注射于1例复发的Ⅲc期卵巢上皮癌患者，治疗结束3个月后复查CT显示转移的腹主动脉淋巴结显著缩小。Peethambaram等[29]对18例难治性及复发性卵巢癌患者应用HER-2/neu基因转导的多肽激活DC进行治疗，18例患者中有2例患者到第48周仍然病情稳定。Chu 等[30]用HER2/neu、人端粒酶反转录酶和细胞表位多肽等抗原多肽负载 DC，制得DC疫苗给11例晚期卵巢癌患者进行多次注射，结果显示3年总生存率为90%,整个治疗过程患者未出现与治疗相关的严重不良反应。这些临床试验证明DC疫苗是安全、有效的，为DC疫苗治疗卵巢癌的临床可行性提供了有力证据。本课题拟同时检测卵巢上皮癌、良性卵巢上皮肿瘤、健康人群尿液及血清间皮素水平，将其与卵巢上皮癌最常用的标志物--血清 CA125 的临床价值作同期比较；同时将尿液及血清间皮素分别联合血清 CA125 检测作为卵巢上皮癌诊断的临床价值作出客观评价；应用负载人间皮素全长cDNA 的慢病毒构建卵巢上皮癌的新型 DC 疫苗，进而通过 DC 作为间皮素的递送细胞，诱导产生具有间皮素特异性的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL），通过 LDH 释放法、流式细胞术、IFN-γ 检测等一系列方法测定 CTL 对卵巢上皮癌细胞产生的特异性杀伤作用。期望通过本课题研究为卵巢癌的早期诊断和免疫治疗提供新的研究思路。

第一部分血清及尿液中间皮素检测在卵巢上皮癌中的诊断价值

前 言目前应用最广泛的、被大家所公认的卵巢癌肿瘤标志物是血清CA125，CA125 已经被广泛用于卵巢癌的诊断、治疗效果评价和病情监测。然而一半以上的早期卵巢上皮癌患者血清 CA125 水平在正常范围[32,33]，同时 CA125 缺乏特异性，在一些良性疾病如子宫内膜异位症、盆腔炎、卵巢囊肿、盆腔结核等疾病中也会出现升高，所以临床上仅单独使用血清 CA125 作为卵巢上皮癌的早期诊断标志物特异性不够，敏感程度也偏低。因此寻求一种特异性高、灵敏度高的联合检测方法以提高卵巢癌的早期诊断率是临床工作中急需解决的问题。间皮素（Mesothelin，MSLN）是1994年Chang 等[12]在分离单克隆抗体1( Mab) 时，发现的一种分子质量约为40 Da的细胞表面糖蛋白，MSLN在正常人体的间皮细胞和许多恶性肿瘤组织（如胰腺癌、卵巢上皮性癌、恶性间皮瘤等）中表述。间皮素基因编码蛋白至少含有两个异构体，其中一个异构体在翻译过程中翻译提前终止，从细胞表面脱落形成可溶性间皮素相关蛋白(Soluble mesothelin related protein，SMRP)[34，35]，其释放入血可以在肿瘤患者的血清中检测到。血清SMRP已被美国食品和药物管理局（Food and DrugAdministration ,FDA）允许作为恶性间皮瘤的诊断的生物标志物[36]。SMRP相对分子质量约为42 - 45Da,远小于CA125蛋白,它不仅在血清中可以检测到，在腹水和尿液中同样可以检测到SMRP[37]。本研究采用酶联免疫吸附试验方法检测卵巢上皮癌患者、良性卵巢上皮肿瘤患者和正常人群的血清、尿液的SMRP水平，结合血清CA125对其诊断效能进行分析,并初步探讨血清及尿液中间皮素检测作为卵巢上皮癌肿瘤标志物的应用价值以及两者分别联合血清CA125检测的临床价值。

材料与方法1 研究对象与标本采集1.1 研究对象2021年3月至2021年9月白求恩国际和平医院妇科及河北省沧州市中心医院妇一科住院手术的卵巢上皮性癌初治患者46例。良性卵巢上皮肿瘤36例。随机选取同期健康体检女性35例作为对照组。其中卵巢上皮癌组及良性卵巢上皮肿瘤组研究对象均经术后病理（由2名副主任医师以上病理医师共同诊断）确诊。所有标本采集前均未经放化疗及激素治疗，而且所有标本采集均得到研究对象知情同意。卵巢上皮癌患者46例，年龄33-69岁，平均年龄54.6岁。其中浆液性囊腺癌26例，粘液性囊腺癌13例，子宫内膜样癌7例。按照国际妇产科联盟（FIGO 2003）手术病理分期标准，Ⅰ-Ⅱ期15例，Ⅲ-Ⅳ期31例。按照世界卫生组织（WHO）病理分级标准G1级9例，G2级14例，G3级23例。良性卵巢上皮肿瘤36例，年龄17-76岁，中位年龄45岁，其中浆液性囊腺瘤21例，粘液性囊腺瘤15例。健康对照组35例，为同期河北省沧州市中心医院健康体检女性,排除恶性肿瘤、妇科疾病、内分泌疾病，心血管疾病等。年龄30-62岁，中位年龄48岁。三组研究对象的年龄无统计学差异（P＞0.05）。选择的所有受检者肾功能均正常。1.2 标本采集采取患者（术前）及健康体检女性空腹静脉血5 mL(促凝剂真空采血管),2h内离心,3000rmp,15min,取上清液-80℃保存待测。同时留取以上患者（术前）及健康体检女性晨尿10 mL,6 h内离心,3000rmp,5min,-80℃保存待测。2 主要试剂与仪器MESOTHELIN酶联免疫吸附试验试剂盒（美国ADL公司）CA125化学发光法试剂盒（瑞士罗氏公司）低温超速离心机(UNIVERSAL-30RF 型，德国 Hettich 公司)-80℃低温冰箱（美国 Thermo scientific 公司）恒温培养箱（美国 Thermo Scientific 公司）普通冰箱（荣事达）恒温摇床（哈尔滨市东明医疗仪器厂）生化免疫分析仪(Cobas 6000，瑞士罗氏公司)快速混匀器（江苏亿通电子有限公司）全自动酶标仪(THERMO MULTISAN M3，美国Thermo Scientific公司)微量移液器（德国 Eppendorf 公司）标准曲线用酶标仪自带统计软件 ELISACalc 绘制,其他统计应用SPSS 18.0 (IBM Corp, Armon, NY,USA)统计学分析软件进行统计学处理,包括方差齐性检验和显著性分析等，测定值以均数士标准差( x 士 s)表示。卵巢上皮癌组、良性卵巢上皮肿瘤组、健康体检组等组间差异性比较采用非参数秩和检验进行，对同一指标两组间的比较用非参数两独立样本Mann-Whitney 秩和检验；对同一指标不同组间的比较(三个或以上)用非参数多个独立样本 rusal-Wallis H 秩和检验；并用 appa 指数判断不同检验结果之间的一致性程度。绘制 ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线，计算 ROC 曲线下面积(area under the ROC curve, AUC)、敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等指标,评价诊断效果。所有假设检验的检验水准定为 α=0.05，以 P <0.05 为有统计学意义。

第三部分 负载间皮素 cDNA 的 DC 疫苗抗卵巢癌细胞 OVCAR3 和SOV3 效应的研究前言65材料与方法66结果74附图77附表84讨论85小结87参考文献88

第三部分负载间皮素全长 cDNA 的 DC 疫苗抗卵巢癌细胞OVCAR3 和 SOV3 效应的研究

前 言目前，以 DC 为基础的肿瘤疫苗主要有以下几种形式：(1)肿瘤裂解物刺激 DC；(2)肿瘤抗原负载 DC；(3)肿瘤细胞与 DC 融合；(4) 抗原基因修饰 DC；(5) 肿瘤细胞 mRNA 转染 DC；(6) 肿瘤凋亡小体致敏 DC；(7)细胞因子基因修饰 DC。Hernando 等[2]用 alpha 叶酸受体特异性肽段 mRNA 转染成熟稳重 DC，治疗一例晚期卵巢上皮癌患者，3 个月后患者 CA125 水平降至正常，转移的腹主动脉旁淋巴结也显著缩小。DC 疫苗的安全、有效性也在其他的实验中得到了证实[3-5]。本部分实验在第二部分-构建负载间皮素 cDNA 的慢病毒载体的基础上，用构建好的慢病毒载体转染由 T 淋巴细胞诱导的成熟稳重 DC，制备成负载间皮素全长 cDNA 的 DC 疫苗，检测该疫苗诱导生成的特异性细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)对卵巢癌细胞系 OVCAR3 和 SOV3 的的体外杀伤活性，并对其效果进行判定。本研究思路是利用DC的抗原递呈功能，以成熟稳重DC为载体将间皮素递呈给其它免疫细胞，从而引发针对间皮素的特异性免疫应答反应。选择间皮素全长cDNA转染DC是希望多表位刺激产生的间皮素特异性CTL能够引发更加强大的细胞毒作用。

结 果1 Western Blot 检测卵巢癌细胞株 MSLN 表述情况间皮素基因编码一个可变剪切位点间皮素前体。其中一个剪切体可形成分子量为 31Da 的巨核细胞促进因子（megaaryocyte potentiatingfactor，MPF），另一剪切体是理论分子量为 40Da 的间皮素。巨核细胞促进因子的功能是刺激骨髓巨核细胞集落形成，如前所述，间皮素为一个锚定于细胞膜表面的糖蛋白。全长间皮素和剪切体形式的间皮素都是 N端糖基化的糖蛋白。在本研究组前期研究中发现，MSLN 在 OVCAR3 和SOV3 细胞中均有表述，本实验进一步确认了 MSLN 在上述卵巢癌细胞的表述。从 Fig.1 中可见，两种细胞都可检测到两条条带，经凝胶电泳分析软件 Quantity One4.4（Bio-Rad）对其分子量进行分析，分子量偏小的条带相对分子量为 48.5Da，较大分子量的条带为 69.2Da。两种细胞中，高分子量 MSLN 的表述不一致，OVCAR3 细胞的 MSLN 表述量高于SOV3，小分子量条带的表述水平一致。2 成熟稳重 DC 数量的检测只有成熟稳重 DC 才具有向 CTL 呈递抗原的功能，为了确保有足够的成熟稳重的 DC 用于呈递 MSLN 给 CTL，采用流式细胞术检测成熟稳重 DC 表面的CD 分子抗体。结果显示，83.07%的 DC 细胞表述 CD80， 85.80%的 DC细胞表述 CD86，有 52.42% 的 DC 细胞表述 CD83。见 Fig.3。

3 MSLN 在转染的 DC 细胞中的表述利用 Western Blot 检测 MSLN 在 DC 细胞中的表述。结果显示，MSLN在转染的 DC 细胞中表述，表现为经转化的 DC 细胞增加了一条分子量约为 70Da 的条带，分子量为 50Da 的位置，处理及对照均有一条非特异性条带，而经转化的 DC 细胞在此位置有两条不易分离的条带，受限于转化细胞的数目，该位置条带的差异难以更清晰的展示。以上结果表明，未转染成熟稳重的 DC 细胞中不表述 MSLN 蛋白，含有 MSLN 的慢病毒载体对DC 细胞的转染效率十分高，DC 细胞可以用做 MSLN 的递送细胞。见Fig.4。5 流式细胞术检测靶细胞凋亡率前面结果证实 MSLN诱导的 CTL对 OVCAR3 和 SOV3 细胞具有高效的细胞毒性，但 MSLN 诱导的 CTL 能够导致多少癌细胞凋亡尚不可知。用流式细胞术检测卵巢癌细胞凋亡率，因 FACS 方法与细胞染色的原理不同，结果也有所不同。OVCAR3 和 SOV3 两种细胞的自然凋亡率分别为23.31%和 6.8%（Fig.6-1A 和 Fig. 6-1B）。当使用负载 MSLN 的 DC 诱导后，产生的 MSLN 特异性 CTL 诱导卵巢癌细胞凋亡率也显著升高，OVCAR3 细胞随效靶比从 2：1、5：1 上升到 10：1，凋亡率也从48.28±1.75%、57.5±1.74%提高到 69.89±3.52%（Fig.6-2A）。对于 SOV3则凋亡率从 12.40±0.81%、17.45±3.18%提高到 27.47±2.21%。未经转染的DC 诱导产生的非特异性 CTL 导致两种细胞凋亡率也有所不同，当效靶比为 5：1 和 10：1 时细胞凋亡率上升，其中 OVCAR3 在效靶比为 5：1和 10：1 时的凋亡率为 17.36±1.66%和 24.05±1.21%，而 SOV3 细胞的凋亡率为 5.24±1.01%和 19.94±2.82%（Fig.6-3A 和 Fig.6-3B），低于负载MSLN 的 DC 诱导的 CTL。两种细胞的凋亡率有显著差异（P <0.05）。

结 论

1 血清和尿液间皮素均在卵巢上皮癌患者中高水平表述，在良性卵巢上皮肿瘤患者和健康体检者中呈现低水平。随着卵巢上皮癌手术病理分期增加和组织学分级降低，血清和尿液间皮素水平显著升高。2 尿液间皮素敏感度低于血清间皮素和 CA125，但是特异度优于后两者。血清和尿液间皮素检测分别与 CA125 联合检测可以在一定程度上弥补 CA125 作为卵巢癌肿瘤标志物的不足，有望成为卵巢癌新的肿瘤标志物，有可能帮助提高卵巢癌的早期诊断率。3 把慢病毒作为免疫治疗中的基因转移载体，将 PCR 扩增获得的间皮素的 cDNA 全长基因构建到慢病毒载体，获得含有间皮素基因的重组慢病毒载体 pBOB-MLSN，利用定量 PCR 方法测定病毒颗粒的滴度，证明负载间皮素基因的病毒载体制备成功。4 重组慢病毒感染成熟稳重的 DC 细胞，将 DC 作为间皮素的递送细胞，诱导 PMBC 产生具有间皮素特异性的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL），对表述间皮素的卵巢癌细胞 OVCAR3 和 SOV3 产生明确的细胞毒作用，并且该作用随着 E：T 比例增高明显升高。流式细胞术检测卵巢癌细胞凋亡率的结果进一步证实诱导产生的间皮素特异性的 CTL 对两种靶细胞均有十分显著诱导凋亡的作用，随着效靶比的增高细胞凋亡率也明显提高。DC-pBOB-1MSLN 诱导产生的 CTL 与对照组相比能够释放更多的 IFN-γ。以上结果提示负载间皮素的 DC 疫苗用于治疗卵巢上皮癌有着良好的应用前景。

参考文献（略）