不同鼠种的肠道菌群在不同饮食结构干预中的组成改变

1前言

人体内居住着大量的微生物，其中大部分位于胃肠道。随着过去20年分子生物学技术的发展，肠道菌群的多样性逐渐被认识。这些分子生物学方法主要用于基于16SrRNA基因序列的系统发育分析，帮助检测和鉴定包括难以培养细菌在内的所有肠道微生物。由于研究方法的限制，早期的肠道微生物群落分析均是基于对少数个体的研究。微生物研究技术的进步使利用高通量'分析（包括利用第二代测序技术和系统发育基因芯片）对数百人进行宏基因组研究变得可行，这些研究已经证实，每个成人个体具有与众不同的且相对稳定的肠道菌群。肠道菌群永久共生菌以厚壁菌门（主要成员为梭菌目）和拟杆菌（主要成员为拟杆菌目）为主要优势菌，其他次优势菌或含量较少的菌门包括放线菌，变形杆菌，梭杆菌和抚微菌。除了细菌，肠道中还居住有产甲烧古细菌和真核微生物。据推测，每个个体中有几百种细菌种系，但各细菌比例在不同个体间高度变异，从而使个体形成与众不同、在一定时间内相对稳定的菌群结构。正是由于肠道菌群的复杂性和个体差异性，目前并无一个明确的对于正常菌群的定义。研究表明肠道菌群随时间推移仍维持相对稳定可能依赖于宿主抗定植力相关编码机制，事实上，肠道菌群随时间推移发生变化大部分是由于肠道中某种原籍菌的丰度发生了改变，而非某种外籍菌的入侵。饮食、药物长期以来被认为是肠道菌群最主要的外部调节因素。人体消化系统自身不能降解谷类、蔬菜、水果等植物多糖，而肠道细菌能编码产生特殊催化酶分解发酵结肠中大量的多糖[7]。肠道细菌代谢产物的种类及生物活性主要由摄入的食物决定，例如膳食纤维在结肠中发酵成短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs)，其中两酸和丁酸已被证实对宿主的肠道及全身有益。而食物的蛋白可被转化为增加动脉粥样硬化和肿瘤风险的代谢产物。由此可见饮食与肠道菌群对宿主的健康与疾病有着重要的作用。

1.1饮食对肠道菌群的影响饮食可通过多种机制影响肠道菌群的组成和活性，目前认为，饮食可以给予某些特定的能利用其成分的细菌选择性生长优势，从而成为改变肠道微生态的主要驱动力。除此之外，饮食结构还能调节一些生理因素，这些生理因素对菌群调节的作用显而易见，但我们对之却又了解甚少，例如，膳食纤维的摄入不仅增加了结肠中细菌的发酵底物，同时还能增加肠續动速率，增加酸的产生而降低肠腔pH。

1.2研究饮食、肠道菌群及健康之间关系的策略1.2.1根据长期的饮食习惯推断饮食对肠道菌群的长期效应为了研究饮食对肠道菌群的影响，可以通过长期饮食习惯或饮食干预方法分别了解其长期及短期影响。对不同饮食习惯的人群或动物进行比较发现，脊椎动物具有使其消化能力适应当前饮食的能力，使其消化酶谱和相关转运蛋白能最大程度地与当前的饮食负荷匹配。研究发现长期饮奶的人群，由于维持成人乳糖耐受基因的单核苷酸多态性，其肠道内乳糖酶活性并不会在断乳后降低。另外，研究表明唾液淀粉酶的基因拷贝数与饮食中淀粉含量呈正相关。同样饮食也能作为肠道菌群的一种生态驱动力，使肠道菌群能适应其长期暴露的饮食结构。最近的一项研究分别对非实验室的肉食动物、素食动物及杂食动物的肠道菌群进行了分子生物学分析，证实了肠道菌群能够反映其饮食习惯、肠道结构和生理。对意大利和非洲儿童的肠道菌群比较发现，后者拟杆菌尤其是普雷沃氏菌属十分丰富，而厚壁菌门则相应较少，同时肠道肠杆菌的含量也显著低于意大利儿童。非西方饮食人群肠道普雷沃氏菌属相对丰富这一点在非洲和美洲印地安人成人肠道菌群比较中也同样得到了证实。非洲农村和亚洲的饮食含有丰富的膳食纤维，能量也比西方同等饮食少35-40%,这强有力地表明高含量的普氏菌是所有以复杂植物多糖为主食人群的菌群特点。对生活在非洲农村、亚马逊的小村庄及美国大都市人群菌群进行比较，发现各自在菌群组成和基因库上存在显著的差异。作为西方饮食结构的一个反映，美国人群肠道微生物组编码大量降解氨基酸和单糖的基因，而发展中国家人群肠道微生物组编码大量淀粉酶基因。已有研究对地理位置、文化背景相同但饮食结构不同的近100名美国人进行了肠道菌群比较，结果表明普氏菌菌型与碳水化合物及单糖高摄入量呈正相关，而与蛋白石及动物脂肪高摄入量呈负相关进一步对这些数据进行分析，发现肠道中最主要的产甲焼古细菌甲烧短杆菌属也与饮食中碳水化合物高摄入量呈正相关。正是基于饮食与肠道菌群之间相互作用的复杂性，本研究选取仍处于肠道菌群建立阶段的刚断乳Balb/c小鼠及SD大鼠作为研究载体，通过为期2个月的不同结构饮食干预方法，采取454高通量测序方法对各个饮食组的大小鼠肠道菌群进行分析，观察并阐明不同的饮食结构下肠道细菌谱的差异，为下一步检测不同的饮食结构下细菌代谢产物谱并寻找菌群及代谢产物两者之间的联系提供理论基础，从而明确饮食、菌群、代谢产物三者之间的关系，为炎症性肠病、肥胖、糖尿病等相关疾病的治疗提供新思路。同时本研究还进一步比较这种饮食对肠道菌群的影响在不同鼠种之间是否存在种属差异，为研究不同人种在同种饮食结构下在肥胖、炎症性肠病等的发病风险上仍存在差异的原因提供线索。

3对象与分组

3.1实验动物2月龄刚断乳Balb/c小鼠、SD大鼠各60只，SPF级，雌性。所有实验用鼠均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。动物实验已获得中南大学湘雅二医院伦理委员会批准。

3.2词料及配方实验词料分为高脂、高蛋白、高糖、高纤维、标准饲料，具体配方与热量密度比例见下表1，饲料由华阜康饲料有限公司特制。各大小鼠适应性喂养1周后进行分组，为保持各处理组之间的均衡性，本研究以体重作为配伍因素，釆用区组随机化分组对照的方法比较试验效果。实验共分为10组，每组10只，分组情况如下：所有大小鼠由专业人员放入清洁房内单笼饲养,控制性条件为室温18°C-22°C,湿度45%-65%，昼夜各12小时，适应性喂养1周，自由饮水。随机分组后，根据分组情况予不同饲料喂养，每天上午喂食,自由饮水，观察8周。实验期间定期换垫料。实验开始之前对大小鼠进行称重、观察大便性状及肠道菌群分析。实验期间密切观察大小鼠一般情况。根据动物分组情况，分别予不同饮食喂养2个月，提前1周每日早晨收集大小鼠类便，每次收集粪便前，按照各大小鼠各自分组及组内编号情况，预先为每只大小鼠一一对应标记冻存管（如正常饮食组第3只小鼠，其对应EP管编号为小正-3;)。釆集粪便时，利用温湿的棉球刺激、轻压大小鼠下腹部，大小鼠新鲜粪便收集于相应冻存管后立即放置于无菌厌氧冰盒内，并于2小时内运送至实验室，一80°C保存备用。参照电泳初步定量结果，将PCR回收产物利用PicoGreen dsDNA定量检测试剂盒进行检测定量，按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。寄往中国上海美吉生物医药科技公司进行454 GS FLX测序。为了得到更高质量及更精准的生物信息分析结果，首先使用seqcln检测接头和修剪末端，使用mothur蹄选序列，去杂优化得到优化序列。将所得到的优化序列按照碱基组成相似性，聚类生成OTU，进而分别利用分析软件：mothur指数分析软件及mothur分类学分析软件，对群落结构进行多样性分析及分类学分析。本研究所涉及的数据结果均为计量资料，数据均釆用均数±标准差(Mean±SD)表示，由于每组仅选3个样本，因此选用了多个独立样本秩转换的非参数检验方法msal-WaUisH检验，对不同饮食组大小属OTU数量、多样性指数及肠道菌群的相对含量进行了显著性分析。各个实验组的上述数据在rusal-Wallis H检验后总体存在差异的情况下，采用Mann-Whitney U检验对各个实验组之间进行两两比较。对于统计学分析应用SPSS 17.0统计软件实现，以p<0.05为差异有统计学意义。

3对象与分组......................73.1实验动物......................73.2饲料及配方......................73.3动物分组及干预......................74实验方法......................94.1动物喂养......................94.2动物粪便的收集......................94.3龚便细菌基因组总DNA的提取一QIAampDNA stool mini it法......94.4 16SrRNA基因序列V1-V3高变区PCR扩增......104.5 PCR产物的定量、混匀及454焦磷酸测序......114.6序列的生物信息分析......................115统计学处理..............................12

7讨论

7.1肠道菌群微生物非培养研究方法长期以来，研究人员主要通过培养的方法对肠道菌群的构成进行研究。随着分子生物学技术的发展，各种分子学技术被广泛用于肠道微生态的研究，主要包括指纹识别技术（变性/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE)、限制性片段长度多. 态性分析（T-RFLP)和测序技术两大类，但所有方法均各有优劣。16S rRNA基因的克隆文库分析是一种传统的研究肠道菌群结构及系统发育的测序技术。该方法涉及鸟枪法克隆，利用引物扩增所有细菌通用基因的一部分，扩增的基因片段称为扩增子/被随机连接到细菌质粒，并通过电穿孔或化学的方法转化到感受态细胞，从而产生克隆库。利用质粒DNA的侧翼区或16S rRNA基因本身的保守序列对插入片段进行测序。测序主要使用双脱氧链末端终止法（Sanger法)，Sanger测序的改进进一步提高了读取长度（约lOOObp)及准确性（高达99.999 %)以及通量（同时在96或384孔进行电泳）。传统的克隆文库方法的显著优势在于：（1)操作相对简易，对基础设备要求较低；（2)各转化克隆仅包含一个单独的代表菌群中一个细菌的插入片段；（3)能够较为容易地对几乎整个16S rRNA基因序列完整测序。（所有九个可变区），因此这种方法十分适用于系统发育分析。

传统克隆文库方法也存在局限性：（1) DNA提取的效率低下、引物的非通用性、PCR抑制剂的存在、不同的16S rRNA基因拷贝数及PCR偏差都可能对结果产生干扰及偏差。常用的减少偏差的策略是减少扩增循环次数。因此，此方法不适用于细菌含量较少的样品或组织（如近端小肠）。另外，当研究者期望对细菌细胞数目存在差异的样品之间进行比较分析，此方法则更不可行；（2)该方法的另一个限制是经济成本。虽然Sanger测序近年来得到了很大的改进，但价格相对昂贵且劳力强度大这一点仍然存在，因此它能够处理的序列数目相对于其它高通量测序方法受到限制。为了获得相关的系统发育数据，通常需要对几乎整个16S rRNA基因完整测序，这种情况下，克隆文库方法的这一缺点就更加凸显。虽然Sanger测序现在可以读取长度可以达到约lOOObp，但从两个方向完成至少两次读取以提供全覆盖近完整的16S rRNA基因并产生重叠群仍是十分必要的。(3)该方法容易形成嵌合序列，为避免这种情况必须特别进行检查。目前有许多可行的嵌合检查方案，包括 BeUerophon、Chimera Chec[和Mallard 。然而，这些方案中没有任何一个方案能对序列是否发生嵌合提供明确指示，最终仍需要主观去进行判断。

8结论

本研究中，所有样品均以厚壁菌门及拟杆菌门为两大主要优势菌，但不同饮食喂养干预可使厚壁菌/拟杆菌比值出现差异，结果表明Balb/c小鼠中，厚壁菌门在普通饮食组相对丰度最高（80.31%)，其次为高糖饮食组及高脂饮食组，而高纤维饮食组中相对丰度最低（13.21%)。同时，高纤维饮食组中拟杆菌相对比例（80%)显著高于其他饮食组。而SD大鼠中，厚壁菌门在高脂饮食组相对丰度最高（85.54%)，高纤维饮食组中相对丰度最低（47.90%)。这提示了长期摄入大量脂肪可能使厚壁菌/拟杆菌比例增加，而长期摄入膳食纤维则可能导致厚壁菌/拟杆菌比例下降。事实上，Tumbaugh 等曾对肥胖小鼠及其瘦小同种、肥胖人群及瘦小人群的肠道菌群进行比较宏基因组学研究，结果表明无论是肥胖小鼠或者肥胖人群，其肠道菌群中厚壁菌门比例均增高，并且这种变化可以影响肠道微生物的代谢功能，使其从食物中获取能量的能力得到提高。但本实验中，SD大鼠局脂饮食组厚壁菌丨]比例1?于其他饮食组，但Bal b/c小鼠尚脂饮食组中厚壁菌的比例反倒低于普通饮食组。这可能与不同鼠种对即使同一种饮食结构的产生反应的敏感性关于，SD大鼠可能高脂饮食反应更灵敏，这也是SD大鼠最常被选用于构建肥胖模型的一个重要的原因。高纤维饮食可以引起大小鼠肠道菌群丰度及多样性降低，不同饮食结构的大小鼠均有厚壁菌门及拟杆菌门为主要优势菌，但各个饮食组厚壁菌门及拟杆菌门的组成比例存在差异，同种饮食结构对不同品系大小鼠（Bal b/c小鼠及SD大鼠）的肠道菌群多样性及群落结构的影响存在种系差异。参考文献（略）