TQ对人肺癌A549细胞增殖、迁移与侵袭的体外研究 百里香醌
第一部分TQ对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响材料与方法2实验方法2.1.2肿瘤细胞的培养及传代用RPMI1640培养液进行培养，当细胞密度达到培养瓶约80%-90%面积时，弃去培养基，用PBS洗1-2次；再加入含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液1ml进行消化，在倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆时倒掉消化液；加入2-3mlRPMI1640培养液并用吸管反复吹打细胞，使之分散形成单细胞悬液，将细胞悬液均分至2个培养瓶内，再分别加入2mlRPMI1640培养液，混匀后放置恒温培养箱内进行培养，培养条件为5%CO2，37℃。2.2MTT法测定TQ对癌细胞增殖活性的影响2.2.1相关试剂的配制(1)MTT溶液配制：0.25gMTT溶于50mLPBS，终浓度为5mg/mL，分装后－20℃保存。(2)TQ的配制：将称取的TQ溶于RPMI1640培养液中，终浓度分别为0,5,10,20,40,80,160μmol/L。2.2.2MTT法测定细胞生存率取A549细胞，以1×l04/ml的细胞悬液，接种于96孔板100μl/孔，置培养箱中培养24小时贴壁后，弃去培养基，分别加入不同浓度的TQ，同时设空白对照组，每组设6个复孔，分别培养24h、48h和72h。用PBS冲洗细胞后，加入5mg/mL的MTT，37℃继续培养4h。然后弃去上层培养基，孔内加入DMSO，摇床振荡混匀10min，最后用酶标仪在570nm波长下测定吸光度值（OD值）。以上实验重复3次。细胞生存率用OD值表示。2.3细胞计数法测定TQ对癌细胞增殖活性的影响2.3.1相关试剂的配制TQ的配制：将称取的TQ溶于RPMI1640培养液中，终浓度分别为0,5,10,20,40,80,160μmol/L。2.3.2细胞计数检测取A549细胞，以1×l04/ml的细胞悬液，接种于96孔板100μl/孔，置培养箱中培养24小时贴壁后，弃去培养基，分别加入不同浓度的TQ，同时设空白对照组，每组设6个复孔，分别培养24h、48h和72h。然后在细胞计数仪上进行细胞计数检测。
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结果1TQ对A549细胞增殖的影响TQ结构式如图Fig.1分别用浓度为0,5,10,20,40,80,160μmol/L的TQ处理A549细胞48h，MTT（Fig.2A）和细胞计数（Fig.2B）的结果显示：TQ对A549细胞增殖起抑制作用，并且随着TQ浓度的增加，其对A549细胞增殖的抑制作用逐渐增强（P<0.01）。另外，TQ浓度为5μmol/L时没有明显的改变A549细胞的增殖活性，而浓度在40μmol/L时明显的改变了A549细胞的增殖活性（Fig.2）。用40μmol/L的TQ分别对A549细胞处理24,48和72h,MTT（Fig.3A）和细胞计数（Fig.3B）的结果显示：随着TQ作用时间的延长，TQ对A549细胞增殖的抑制作用逐渐增强（P<0.01）。这些结果说明TQ对A549细胞增殖具有抑制作用，并且这种抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。为了进一步证明TQ对A549细胞增殖的抑制作用及其剂量和时间依赖性，我们检测了TQ对A549细胞增殖的标志性基因PCNAmRNA和蛋白表述的影响，研究结果显示：TQ对A549细胞PCNAmRNA和蛋白表述的抑制作用具有剂量依赖性（Fig.4，Fig.5；P<0.01）和时间依赖性（Fig.6，Fig.7；P<0.01）。2TQ对A549细胞迁移的影响划痕实验成像如图Fig.8。划痕实验结果显示：分别用浓度为10,20,40μmol/L的TQ处理A549细胞48h，随着TQ浓度的增加，迁移细胞的数量减少（Fig.9；P<0.01）。另外，用40μmol/L的TQ分别对A549细胞处理24,48和72h,随着TQ处理时间的延长，迁移细胞的数量减少（Fig.10；P<0.01）。结果表明：TQ对A549细胞迁移起剂量依赖性和时间依赖性抑制作用。3TQ对A549细胞侵袭的影响Transwell小室实验成像如图Fig.11。Transwell小室实验结果显示：分别用浓度为10,20,40μmol/L的TQ处理A549细胞48h，随着TQ浓度的增加，细胞侵袭活性逐渐下降（Fig.12；P<0.01）。另外，用20μmol/L的TQ分别对A549细胞处理24,48和72h,随着TQ处理时间的延长，细胞侵袭活性逐渐下降（Fig.13；P<0.01）。结果表明：TQ对A549细胞侵袭起剂量依赖性和时间依赖性抑制作用。
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第二部分TQ对A549细胞MMPs活性与表述的影响
前言肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌是最常见的病理类型。肺癌发生转移是导致肺癌患者最终死亡的重要因素。肿瘤的发展转移是一个复杂的过程，首先是癌细胞无限制性的生长，然后癌细胞自原发肿瘤上脱落，侵入周围组织或渗入血液和淋巴系统。最终，癌细胞定居在靶器官[1]。近年来，随着对肺癌发生、发展、侵袭和转移等相关分子机制的深人研究和探讨，许多与肺癌发展及转移密切相关的物质被发现及证实.大量国内外相关研究均揭示基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）与肺癌的发生、发展、侵袭、转移及预后等紧密相关，但目前仍尚有一些作用机制不明确。MMPs 是一种由肿瘤细胞分泌的锌离子依赖型内肽酶。MMPs 在生理和病理过程中可以降解多种细胞外基质成分，例如：胶原，纤维结合蛋白，蛋白多糖，层粘连蛋白和弹力蛋白[2-4]。因而，MMPs 在肿瘤的发展转移过程中起重要作用。其中，MMP2 和 MMP9 在癌症的多个阶段过表述并降解 IV 型胶原，尤其在高度转移性癌症中表现明显，例如：肺癌[5-7]。因此，抑制 MMP2 和 MMP9 可能是肺癌细胞的一个治疗靶点。本部分的目的是研究 TQ 对 A549 细胞 MMPs 活性与表述的影响，进而探索 MMP2 和 MMP9 在 TQ 抑制肺癌发展转移中所起的作用。
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材料与方法2 实验方法2.2.3.2蛋白样品处理
将蛋白样品与 5×上样缓冲液以 4：1 的比例混匀，100℃变性10min，冷却至室温，备用。2.4.3.3 Western Blot步骤（1） 安装电泳槽的玻璃板，以 0.5% 琼脂糖封边， 于玻板间先灌入 10%的分离胶，以去离子水封闭 30min 等待分离胶凝固；（2）分离胶聚合完全后，尽量除去上层水，灌入 5% 积层胶并插入1.5mm 的 Teflon 梳子（小心避免混入气泡）；（3）积层胶聚合完全后，小心拔出 Teflon 梳子，在内外电泳槽中加入电泳缓冲液，将处理好的样品按蛋白定量结果上样 60μg，80V电压进行电泳，待样品进入分离胶后，电压更换为 120V；（4）当溴酚兰在分离胶内泳动至距接近琼脂糖封边胶 0.5cm 时，停止电泳。（5）以蛋白 Marer 定位，将样品所在凝胶切下，按照凝胶大小剪裁 PVDF 膜及滤纸；（6）电转仪上自阴极至阳极依次铺制：海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵（注意避免层与层之间气泡产生）；（7）接通电源，4 ℃转膜过夜；（8）转膜后将 PVDF 膜置于丽春红染液中观察转膜情况。将膜放于含 5%脱脂奶粉的 TBST 溶液中封闭，37℃摇动 1-2h 或封闭过夜。（9）用一抗抗体滴在膜的蛋白质面上，4℃静置孵育过夜。（10）1×TBST 洗膜 3 次，10 min/次。（11）加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:10000 稀释）室温下反应2h。（12）1×TBST 洗膜 3 次，10 min/次。（13）增强化学发光法使蛋白条带发光并在X光片上曝光显影。目的蛋白的相对含量以目的蛋白与内参蛋白 β-actin 的 Volume 比值表示。
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第四部分 TQ 通过 ER1/2 信号通路抑制 A549 细胞的增殖、迁移和侵袭前言64材料与方法65结果68附图70讨论75小结76参考文献76结论80
第四部分TQ 通过 ER1/2 信号途径抑制 A549 细胞的增殖、迁移和侵袭
讨 论越来越多的证据证实 TQ 具有很强的抗癌作用。TQ 的抗癌作用在肺癌细胞也得到了证明。但是，TQ 对肺癌的抗肿瘤作用及其分子机制仍未被完全阐明。肺癌细胞的迁移和侵袭与 MMPs 紧密相关。MMPs 是一组 Zn+依赖性内肽酶，由肿瘤细胞分泌，能降解多种细胞外基质，包括：间质内胶原，基底膜胶原，纤维结合蛋白，层粘连蛋白和多种的蛋白聚糖[15,16]。细胞外基质的降解是恶性肿瘤转移的关键步骤之一, 只有完成了对细胞外基质的降解才使肿瘤细胞突破细胞外基质（extracellular matrix, ECM）构成的结构屏障及毛细血管基底膜,从而向周围组织侵袭或进入血液循环及淋巴系统,然后在循环系统中迁移,逃避机体免疫监视系统,穿过毛细血管进入远处组织或器官内,在远处组织或器官内着床,肿瘤血管生成,最后在远处形成转移灶。大量的研究结果显示，MMP2 和 MMP9 在多种癌组织中呈高度表述，且与癌的分化程度、远处转移情况、肿瘤组织学类型及预后紧密相关。并且，有报道指出 TQ 降低癌组织中 MMP2 和 MMP9 的表述和活性。但是，TQ 对肺癌细胞 MMP2 和 MMP9 表述的影响很少有研究。我们第二部分的研究结果显示，TQ 对 A549 细胞 MMP2 和 MMP9 的活性和表述具有剂量依赖性抑制作用。肺癌的发展转移与细胞内信号通路的改变也有密切联系。MAPs 信号转导通路在细胞外各种信号刺激下被激活，从而参与细胞的各种生理及病理活动，包括细胞生长、增殖、分化和凋亡[21,22]。ER1/2 信号通路是最早被鉴定出来的一种MAPs信号通路。因其可被多种细胞外信号激活，故被称为细胞外信号调节激酶。细胞受到外界刺激时，各种胞外信号与细胞膜上的受体结合，使得 ER 被磷酸化激活，发挥其生物学效应。它通过基因调节细胞的增殖和生长。在多数肿瘤中，存在 ER1/2 被激活，呈明显高表述[17-20]。并且，ER1/2 通路在许多肿瘤的迁移和侵袭过程中起重要作用，例如：前列腺癌，口腔癌，肝细胞癌和肺癌[5-8]。大量的研究显示，抑制 ER1/2 信号通路，可以抑制肿瘤的发展。有研究显示MAPs 通路与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关。我们第三部分的研究结果显示，TQ 对 A549 细胞 ER1/2 蛋白的磷酸化具有时间依赖性抑制作用。越来越多的研究显示，癌细胞的迁移和侵袭与 MMP2 和 MMP9 的表述和活性改变涉及 MAPs（N 1/2, ER 1/2, and p38）[4]。为了证实 TQ对 A549 细胞的抑制作用是否依赖于其对 ER 1/2 信号通路的影响，我们采用 TQ 与 ER 1/2 抑制剂 PD98059 联合作用的方法来检测 TQ 对 A549细胞增殖，迁移和侵袭及 MMP2 和 MMP9 的活性和表述的影响。研究结果显示，TQ 抑制 A549 细胞 ER1/2 的磷酸化；抑制 A549 细胞 MMP2和 MMP9 的表述和活性；降低 A549 细胞的增殖、迁移和侵袭活性。这些研究结果说明，TQ 可以通过抑制 A549 细胞 ER1/2 的磷酸化降低MMP2 和 MMP9 的表述和活性，从而降低 A549 细胞的增殖、迁移和侵袭活性。
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结论
肺癌作为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康。肺癌的发展转移除了与某些基因的点突变关于外，与细胞内信号通路的改变也有密切联系。细胞信号通路的过度活跃或阻断均影响细胞增殖分化、周期和凋亡等方面的自我调控，导致细胞增殖凋亡的失衡，最终导致肿瘤的发生和发展。有研究显示MAPs通路与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关,但其具体机制尚不明确。我们的研究结果显示，TQ对A549细胞N，p38蛋白的磷酸化没有明显的影响，但是其对A549细胞ER1/2蛋白的磷酸化具有时间依赖性抑制作用。结果表明TQ可能通过抑制ER1/2蛋白的磷酸化来影响癌细胞的ER1/2信号传导通路，从而抑制癌的发展转移。TQ 可以通过抑制 A549 细胞 ER1/2 的磷酸化,降低 MMP2 和 MMP9的表述和活性，从而降低 A549 细胞的增殖、迁移和侵袭活性。这些结果表明 TQ 对人肺癌的发展转移具有潜在的治疗作用。......
参考文献（略）