Niban在肾间质纤维化中的研究

前言

由于慢性肾脏疾病(Chronic idney disease, CD)的患病率不断升高，预后差，治疗费用高，CD目前已成为全球主要的公共健康问题之一。王海燕教授等对我国13个省市50550例成年受试者展开调查，通过估算eGF<60 ral/min/1. 73m2或存在白蛋白尿来诊断CD； 2021年王海燕教授等在《柳叶刀》上发表首个中国CD横断面调査表明，我国CD总患病率达10.8%，参考我国的人口基数，CD患者数量十分巨大，接近1.2亿[5]。随着病程不断推进，CD逐渐发展为肾纤维化，最终进展到终末期肾病。可以说，肾纤维化是各种肾脏疾病进展到终末期肾病的共同途径和主要病理基础[6],其病变程度与CD的预后密切相关。延缓CD发生、发展的关键是控制肾纤维化[7]。肾纤维化主要包括肾小球硬化和肾间质纤维化（Renal Interstitial Fibrosis，RIF)。RIF的程度预示着患者有效肾单位受损的程度[8]，即使在原发性肾小球疾病中，肾间质损伤的程度与CD的进展更为相关[9-15]。因此，研究RIF的作用机制，寻找RIF的生物标志物，探索防治RIF的有效措施，对于延缓CD的进程意义重大，具有广泛的社会效益和经济效益，是目前全球肾病研究的热点和难点。肾间质纤维化的发生机制十分复杂，受多方面因素的影响。肾小管上皮细胞调亡炎症反应[18],氧化应激[19]，成纤维细胞增殖、活化，实质细胞转分化，多种细胞因子（包括TGF-β、CTGF等）及血管活性物质（包括血管紧张素II、内皮素等）的产生,细胞外基质合成和降解失衡等均参与其中。虽然发病机制繁多纷杂，但肾间质纤维化发生、发展过程的核心机制尚不明确；己有的研究结果并不能完全解释肾间质纤维化的发病过程，应该还存在尚未引起重视的、可以影响肾间质纤维化过程的新蛋白、新机制。在寻找肾间质纤维化新的影响因子、机制的研究中，传统的分子生物学方法属于垂直型的研究，即釆用多种手段研究个别的基因和蛋白质，只能对某一个或几个因子进行局限性的探索，研究面较窄。而近年来以蛋白质组学、气基因组学等为代表的高通量技术方法，属于水平型研究，即以同一技术方法同时对数量巨大的基因及蛋白质进行鉴定、分析，为我们的研究提供了新的技术平台。从诞生到现在，组学的研究取得了令人瞩目的进展，它不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多疾病机制的阐述提供理论依据和解决方案，已经成为生命科学研究与探索的核心技术。蛋白质组学是对一定时间或环境条件下表述的所有蛋白质的研究，是从整体水平上对蛋白质的特征进行的研究。由于大部分细胞生命活动发生在蛋白质水平，蛋白质组学研究将直接阐明生命在生理或者病理条件下的变化机制。蛋白质组学研究内容包括蛋白质的表述水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等。通过蛋白质组学研究，可以获得对于细胞代谢、疾病发生等过程的整体认识，以发展的、全面的角度对生命现象的规律进行探索。蛋白质组学研究的基本支撑技术包括分离/分析技术、质谱鉴定、计算机图像分析与大规模数据处理技术、数据库。蛋白质组学按照研究对象可以分为全蛋白质组学和差异蛋白质组学。差异蛋白质组学目前被认为是蹄选临床治疗、药物IE点最为有效的研究方法之一。差异蛋白质组学的研究方法主要包括双向凝胶电泳、双向焚光差异凝胶电泳、高效液相色谱技术、应用同位素标记相对和绝对定量（Isobaric Tags for Relative andAbsolute Quantitation, iTRAQ)技术等分离技术及质谱鉴定技术。既往广泛使用的凝胶电泳，由于其低灵敏度、无法检测低丰度蛋白质的局限[28]，近年来科研工作者越来越多的关注到同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ)技术的应用。与凝胶为分离技术研究基础的定量方法比较，iTRAQ技术可以捕获丰度更全的蛋白质，且无需凝胶电泳即可进行多样品分析，从而成为研究疾病过程、药物疗效与祀点的有力手段之一。蛋白质组学、基因组学协同转录组学、代谢组学等构成了系统生物学的组学生物技术基础，为生命科学研究提供了庞大的数据库；这不仅给生命科学提供了快速、整体研究的条件，也使组学之间的联合研究成为可能。基因组学和蛋白质组学是不同层面的分子生物学研究，它们分别对基因和蛋白质的结构、功能、相互作用网络进行研究。将基因组学和蛋白质组学联合起来分析研究，相互支持和完善生物信息的数据，将为科研工作者提供有力的帮助。目前联合基因组学及蛋白组学技术对生命科学进行的研究越来越多，进展十分迅速。高通量工具在生命科学中的联合应用，对认识、描述、定量基因/蛋白，甚至代谢产物的整体特征有重要意义。

1肾间质纤维化差异蛋白的筛选

1.1引言近年来，在寻找肾间质纤维化生物标志物及新机制研究中，以蛋白质组学、基因组学为代表的组学研究取得了令人瞩目的进展。组学研究摒弃了传统的分子生物学方法研究面较窄的缺点，结合基因、蛋白质结构及功能分析、计算机图像与大规模数据处理等技术，给生命科学的研究提供了高通量的基础，为我们的研究提供了技术平台。本研究以3天、7天、14天、21天UUO大鼠肾组织为研究对象，釆用iTRAQ技术联合基因芯片分析，蹄选UUO大鼠肾脏病变过程中有意义的差异蛋白，为进一步寻找肾间质纤维化发生、发展中可能的标志物及治疗IE点提供理论依据。

1.2材料和方法所有的动物操作程序遵照美国国立卫生研究院（NIH)指南。动物研究符合中南大学动物管理委员会管理条例，同时于2021年3月获得湘雅三医院伦理委员会批准（批准号：S172)。雄性清洁级SpragueDawley(SD)大鼠25只（180-220g/只），购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，（许可证号SCX(湘)2009-0004,合格证号NO.HNASL20210025)。所有的大鼠饲养于中南大学湘雅医学院实验动物学部，清洁级无菌动物飼养房内，每笼2-3只。饲养房内恒温恒湿，室温控制在23±2°C，相对湿度55±2%,每12小时进行交替光照。大鼠自由进食，其词料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，食物、水源及塾料在使用前均经紫外线消毒处理。所有大鼠实验开始前均适应性喂养一周。所有操作（包括大鼠称重、单侧输尿管结扎手术及处死等)，均经酒精消毒及紫外线照射灭菌后，在超净操作台内进行。雄性SD大鼠25只，适应性喂养一周，后随机分为：假手术组（SHM,5只)、UUO模型组（UUO,20只）。除假手术组大鼠外，其他大鼠在无菌条件下行改良左侧输尿管结扎术[38]。10%水合氯醛麻醉后，固定大鼠。常规去毛、消毒，戴无菌手套，铺无菌孔巾，在大鼠脊柱左侧约1cm、背部左侧助腰点下约0.5cm作一纵向切口，1.5-2cm长；充分暴露肾脏，以小弯镊轻轻剥离大鼠左肾包膜，分离输尿管；丝线结扎后断离输尿管，庆大霉素生理盐水冲洗腹腔，逐层缝合；再次消毒皮肤后，覆盖无菌纱布，置于无菌饲养笼，待大鼠麻醉清醒后放入原饲养笼。假手术组大鼠以同样的术式进行，但仅分离左侧输尿管，不结扎、不剪断输尿管，其余步骤相同。UUO组大鼠在术后3天、7天、14天及21天分别随机处死5只；假手术组于术后14天处死。处死前以10%水合氯醛经腹腔麻醉大鼠，后留取左侧梗阻肾标本及14天UUO组大鼠健侧肾标本。肾标本沿矢状面小心剖开，分成3部分：背侧肾组织用冰生理盐水快速冲洗后，在4%多聚甲醛中固定24小时，常规脱水石蜡包埋，行HE染色及免疫组织化学染色等；腹侧上半部分取肾皮质，用冰生理盐水冲洗后，迅速放入液氮中保存，以备后续提取组织蛋白，行蛋白质组学分析及Western Blot；腹侧下半部分取肾皮质，用冰生理盐水快速冲洗后，放入液氮中保存，以备后续提取组织RNA，行基因芯片及Real-time PCR检测。肾组织在4%多聚甲醛中固定一天后，依次浸入70%、80%的乙醇各半小时、95%的乙醇2次各半小时、无水乙醇2次各半小时、二甲苯透明2次各15 min后，置于包埋盒中，60℃恒温下，浸蜡2小时，进行包埋。冷却后切片（3-4un)，贴于多聚赖氨酸处理过的洁净防脱玻片上，60℃恒温箱内，拷片2小时，待染色检测。

2 Niban在肾间质纤维化中的表述...............342.1前言....................................342.2材料和方法....................................342.2.1材料....................................342.2.2实验方法....................................362.3统计学分析....................................533 Niban在肾间质纤维化中的作用机制探讨...............643.1前言....................................643.2材料和方法....................................643.2.1材料....................................643.2.2实验方法....................................66全文总结....................................89

3 Niban在肾间质纤维化中的作用机制探讨

3.1前言肾间质纤维化以肾小管扩张和间质纤维化为特征，与慢性肾脏病的进展密切相关肾间质纤维化的作用机制复杂，涉及到多个步骤及环节。其中，肾小管上皮细胞凋亡在肾间质纤维化形成中起重要作用。凋亡（Apoptosis)也称为程序性细胞死亡;，是一种遗传控制的生理性死亡。在正常情况下，调亡起消除老化细胞或未参与免疫反应的淋巴细胞的作用；而发生病理性改变时，凋亡可以对肿瘤生成在内的多种病理情况起作用。时至今日，已经在多种肾脏疾病中，观察到了肾小管上皮细胞调亡的现象。Niban是一种功能蛋白，它可以通过影响真核转录起始因子eIF2a及S61/4E-BP1磷酸化，在转录水平调节细胞死亡信号；Niban还通过竞争性措抗MDM2 (AT通路下游的一个作用底物)，导致P53降解增多，发挥抑制凋亡的作用。Niban在肾间质纤维化中的作用及机制，尚不明确。

3.2材料和方法对照组（Control) H-2细胞形态基本正常，为卵圆形，仅有极少数细胞核呈棕黄色，提示细胞调亡；而TGF-β1(10ng/ml)刺激H-2细胞48小时后（TGF-β1组），H-2细胞形态发生变化，极性增大，拉长拖尾，呈现纤维化现实，显微镜下可见棕黄色核的细胞数量明显增多，细胞调亡明显增加。空转对照组（Control)中H-2细胞形态基本H常，为卵圆形，有极少数细胞核呈棕黄色，提示细胞调亡；Niban SiRNA转染H-2细胞48小时后，H-2细胞形态发生变化，极性增大，拉长拖尾，呈现纤维化现实，但程度不及TGF-β1组，显微镜下可见棕黄色核的细胞数量明显增多，细胞调亡增加。肾间质纤维化以肾小管扩张和间质纤维化为特征，与慢性肾脏病的进展密切相关。肾间质纤维化的作用机制十分复杂，涉及到多个步骤及环节，肾小管上皮细胞调亡、肾小管上皮细胞及成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化、巨唾细胞浸润、炎症、氧化应激、多种细胞因子及血管活性物质产生等均参与其过程。肾小管是连接肾小球与肾间质的枢纽，在肾间质纤维化过程中，肾小管上皮细胞凋亡增多，可导致肾小管扩张/萎缩。可以说，肾小管上皮细胞调亡是肾间质纤维化的重要发病机制之一。在肾脏疾病的研究领域中，细胞凋亡在肾脏发育、多种肾脏疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用。目前在多种肾脏疾病的动物模型（包括UUO、糖尿病肾病、高血压及5/6肾切除大鼠）中，均观察到了肾小管上皮细胞凋亡的现象。倜亡既是肾功能损伤的结果，也是肾损伤持续的原因；过度凋亡可以导致肾脏病理结构改变、肾功能损伤形成。肾脏疾病时，肾小管受到缺氧、中毒、细胞/炎性因子、血装蛋白或葡萄糖等因素作用后，肾小管上皮细胞凋亡增加，最终导致肾小管扩张、萎缩及间质纤维化形成。肾小管上皮细胞凋亡可由TGF-β1、 AngII[93]、高糖[94]、氧化应激[95]等多种刺激因子诱发，主要受凋亡正向调控基因（Bax等）及调亡负向调控基因（Bcl-2等）的调控。细胞凋亡信号除了死亡受体通路、线粒体通路[97]这两条主要信号转导途径外，还可以通过内质网应激[98]、粒酶B/P53等[#1^]介导的调亡通路。肾间质纤维化发生、发展的过程中，如果能够积极干预治疗、减少肾小管上皮细胞凋亡形成，则有可能减轻肾脏病理损伤、延缓肾间质纤维化形成。

全文总结

1)肾间质纤维化时，肾小管上皮细胞凋亡增加，Niban表述减少，两者趋势相反；2)沉默Niban的表述，可以引起H-2细胞凋亡增加，提示Niban可能参与肾小管上皮细胞调亡所致的肾间质纤维化；3)Niban在肾间质纤维化中对H-2细胞凋亡的调节，不通过TGF-β1通路。

参考文献（略）