microRNA

前言

目前化学药物仍然是控制惊厥发作最有效、最重要的干预手段，但常用一线抗癫癎药(AEDs)只能控制70%左右的痫性发作，并不能预防癫癎病灶的产生，更不能缩短惊厥的自然进程。不仅如此，抗癲癎药还通常伴有各种不良反应，常见有肝肾功能损害、智力影响及皮疫等，长期应用安全性较差，致使大多数患儿的依从性下降，因此开发新的抗惊厥药物是我们急需攻克的难题。结合我国人口基数大、惊厥患儿更为集中等特点，从新的角度发掘惊厥的发病机制及开发临床药物任务更为艰巨。目前对于惊厥发病机制异常复杂，目前尚无统一结论，其中神经元损伤及突触可塑性的异常为大多数人所接受。脑组织内具有含量极为丰富的神经元，是维持正常脑功能的生理基础，这些神经元之间的联系主要通过突触介导。神经细胞调亡是神经细胞死亡的一种形式，也是异常兴奋性突触环路形成的重要原因。许多资料显示癫癎发作后，神经细胞调亡数明显增加，导致神经元间突触联系重组的神经可塑性变化，造成不可逆性脑损伤。突触连接在结构和功能上的修饰称为突触可塑性，是学习记忆形成的分子学基础，通常包括结构及功能可塑性，其中结构可塑性是功能可塑性的物质基础，形态的变化常常伴随着机能的改变。研究发现，突触可塑性的变化与神经系统发育、损伤后修复以及学习记忆等脑的功能密切相关。业己发现在癫癎患者发作后大脑内神经元可塑性发生了显著变化，表现为神经元之间形成异常的突触联系，建立起病理性神经环路，导致大脑兴奋性增强，加剧兴奋性脑损伤。Micr0RNAs (miRNAs)是由高等真核生物基因组编码，长度为20-22个核苷酸的非编码单链小分子RNA。miRNAs作为重要的基因调控因子，在胚胎发育、细胞增殖及凋亡、脂肪代谢以及在基因表述调控的过程中发挥着不可替代的作用。成熟稳重miRNA对m基因的调控主要依赖于与紀mRNA3'-UTR完全或不完全互补配对实现，进而诱导紀mRNA的降解或转录抑制，发挥基因表述调控功能。目前大量研究表明miRNAs表述及功能的异常参与了多系统疾病的发生发展过程，如肿瘤、心血管系统、神经系统疾病及免疫系统疾病等，其中在神经系统疾病中的作用越来越为人们所关注。神经元内存在有多种miRNAs的表述，参与这些miRNAs参与了神经元存活与调亡、轴突延伸及重塑及突触形成过程的调控。W0ng等人近来发现miR-132及miR-212的抑制能加剧体外培养神经元的凋亡，而它们的过表述则在一定程度上缓解氧化应激后的细胞损伤，发挥神经保护作用。神经轴突上有大量mRNAs表述，参与了信号转导、mRNA翻译、蛋白转运及降解、细胞骨架管理以及RNA沉默等过程相关蛋白的转录调控，其中信号传导通路丝裂原激活的蛋白激酶（MAP)、CaMI以及蛋白酶C途径在感应突触连接的形态改变以及长时程增强（LTP)发挥着重要作用。轴突的形成通常涉及了细胞骨架的重构，这一过程通过MAP2区域性翻译介导。而CaMII与突触后密度95 (PSD-95)在突触后轴突形成过程中发挥着支架作用，两者的表述同样具有区域特异性。近年来，G00dman等人成功制作了 iniR-132和/或miR-212条件性缺失的小鼠模型，结果发现，同时敲除miR-132/212小鼠轴突长度明显缩短，轴突生成减少，密度降低。因此，进一步明确miRNAs对于发育期惊厥性脑损伤后神经元调亡及突触可塑性的调控具有重要临床意义，能够为临床开发新的抗惊厥药物提供新的祀点。iniR-204是目前研究较为广泛的一种miRNA，在血管平滑肌细胞、肝、肾、胃肠道及中枢神经系统内均有分布。miR-204在肿瘤中的异常表述是当前研究的热点，现已发现多种肿瘤患者体内miR-204的表述远低于正常组，致使抗凋亡因子Bcl-2表述上调，加速肿瘤恶化，影响疾病预后。但是，关于miR-204在中枢神经系统中的作用尚处于起始阶段，早前Natera-Naranj0等学者已证实miR-204表述于轴突，且在远端轴突的分布远高于初级交感神经元胞体，从侧面证实其可能在维持轴突结构、功能及神经元的发育及成熟稳重方面发挥重要作用，但目前仍缺乏相关具体机制及活体实验研究。

第一部分反复惊嚴性脑损伤脑组织内特异性miRNAs表述的改变

前言惊厥是婴幼儿时期最常见的中枢神经系统疾病，能导致发育期不同程度脑损伤，发生率约占全体儿童的4%-6%，其中20%表现为反复发作或惊厥持续现实(Status c0nvulsi0n, SC)。而在SC患者中，约20%?40%患儿可出现运动发育落后，严重者可导致智力障碍和情感障碍，甚至危及生命传统的抗惊厥治疗主要依靠抗惊厥或抗癫癎药物，但是仅能缓解惊厥发作或减少惊厥的发生率，而不能从根本上祛除惊厥的发病机制。目前对于惊厥发病机制异常复杂，目前尚无统一结论，越来越多的证据显示表观遗传因子参与了惊厥的发作及发展过程的调控，其机制可能与诱导一系列惊厥相关蛋白的转录后抑制关于[4]。因此人们开始寻找开发新抗惊厥药物的途径，而micr0RNAs是当前研究的热点之一。Micr0RNAs (miRNAs)是一组由高等真核生物基因组编码的非编码单链小分子RNA。成熟稳重miRNA通过与IE mRNA3-UTR完全或不完全互补配对，进而诱导祀mRNA的降解或转录抑制，调控基因的表述。正是因为其特殊功能，miRNAs在多系统疾病中均发挥着重要作用，而我们最为关注的是其在中枢神经系统疾病中的作用及相关机制。miRNA在神经系统分布广泛，利用miRNAarray技术已经发现在脑发育的不同阶段至少出现有125种miRNAs，约占目前已经发现的miRNAs的70%。miRNAs在中枢神经系统的表述具有物种、时间及空间特异性，Hua等人发现有30多个miRNAs特异性表述于小鼠神经组织_，Wheeler等从小鼠胚胎脑组织中克隆了新的miRNAs，包括miR-652、miR-721和rniR-410,并发现它们特异性地表述于脑和脊髓组织。大多数表述于神经细胞的miRNAs在胞体内完成翻译过程，它们的区域性翻译在神经元存活、轴突延伸、轴突重塑、突触形成以及突触可塑性等过程中充当着不可替代的角色神经元的调亡与存活对于评价脑损伤预后至关重要，既往关于miRNAs对神经元洞亡的影响主要集中于中毒、脑损伤及神经退性变等方面，而在惊厥性脑损伤中的研究尚处于初始阶段。Huang等人证实了 miR-34a能通过负性调控抗凋亡因子Bcl-2的表述抑制百草枯中毒后的神经元调亡[15]，而miR-139-5p则能下调新生鼠脑内人类生长转换相关的蛋白（Human gr0wthtransf0rmati0n dependent pr0tein (HGTD-P))的表述调节缺血缺氧性脑病诱发的神经元调亡[16]。学习记忆的形成与巩固有赖于新蛋白的合成必需定位于突触上[17]，而突触可塑性的改变是惊厥发作的另一重要病理机制。Pars0ns等人首次探寻了参与学习记忆、认知及忧虑行为过程中特异性表述的niiRNAs，结果发现学习记忆过程涉及了多种miRNAs的改变，如miR-34c、miR-323、miR-378以及miR-451等。除mir-34c之外，其它miRNAs同样参与了认知行为的形成过程，而miR-34c及miR-323均是忧虑行为的调控因子，但目前仍缺乏相关具体机制的研究。

材料与方法20日龄SD大鼠60只，雌雄不限，体重30-38g,由湖南省农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供，清洁条件下喂养。将实验大鼠随机分为2大组，即对照组及惊厥组，每组又随机分为5个时间点，每时间点各6只大鼠。惊厥组通过三截乙醚反复吸入(每天1次，连续6天)制作发育期反复惊厥动物模型，分别于末次惊厥后2h、6h、24h、72h及7d断头取脑，分离海马组织，液氮中冻存。另取20日龄SD大鼠36只，随机分为6组，即对照组，惊厥后2h，惊厥后6h，惊厥后24h，惊厥后72h，惊厥后7d组，每组各6只大鼠，惊厥组大鼠应用三赢乙醚吸入制作发育期惊厥模型，分别于末次惊厥后2h、6h、24h、72h及7d进行脑组织的灌流固定，而对照组则在出生后28d (相当于末次惊厥后24h)进行脑组织的灌以固定。分别于末次惊厥后2h、6h、24h、72h、7d水合氯醛（0.3g/g)腹腔麻醉发育期反复惊厥后大鼠，打幵胸腔，剪开右心耳，经左心室、升主动脉用灭菌用水持续冲洗至流出液为无色清亮，随后注入约150ml 4%多聚甲醛灌注固定脑组织30min。取出大鼠大脑，分离出双侧海马，置于灌流液内，4°C固定过夜后将标本转入20%的庶糖溶液中，继续放置于4°C，直至标本沉底，标本常规石蜡包埋。石蜡切片厚约4nm，松节油处理l0min后，再置于新鲜的松节油中处理l0min，随后依次置于无水乙醇中干预5min，85%乙醇干预5min，70%乙醇干预5min，新鲜配置的0.01MTBS清洗2次。依次加入lulTdT、lul DIG-d及18ul标记缓冲液，轻轻混勾，加至每张玻片上，湿盒中37°C温育2h，TBS (0.0IM)清洗3次，封闭液室温处理30min，尽量思干液体，不洗，再滴加抗体稀释液（1: 100)稀释的生物素化抗地高辛抗体，温盒中37°C温育Ih，TBS (0.0IM)清洗3次。再滴加以抗体稀释液（1: 100)稀释的SABC-AP，37°C温育Ih，TBS (0.01M)清洗4次。将显色液按1: 20用TBS (0.01M)稀释，轻轻混匀，滴加至标本上，37°C显色30min，充分水洗，DAPI避光染核。最后至倒置焚光显微镜下观察。

第二部分惊厥性脑损伤后大鼠海马神经元凋亡及..........27突触可塑性的改变................................27前言................................27材料与方法................................30实验结果................................39第三部分miR-204通过SIRT1调控惊厥性脑损伤过程及..........51相关机制................................51前言................................51材料与方法................................53结果................................63总结........................73

第三部分miR-204通过SIRT1调控惊厥性脑损伤过程及相关机制

前言MicroRNAs是一小分子RNAs，通过与IE基因3-UTR的特异结合，在转录后水平调节勒基因的表述，进而调控一系列生理病理过程，包括神经元的分化及凋亡、突触可塑性的形成与发展等。大量研究证实，每个miRNA都拥有数个甚至数百个不同的IE基因，通过对不同IE基因的表述影响实现对多系统生理病理过程的调控。随着对miRNAs研究的不断深入，我们更关注的是单个miRNA在不同病理情况下的具体作用及相关机制研究。SIRT1是一种依赖于NAD具有高度保守性的去乙醜化酶，受多种miRNAs的调控[4]。近来学者统计，有文献报导的miRNAs已达30余种，包括miR-146、miR-126、miR-34a等，通过负性调控SIRT1的表述参与脂肪肝、肿瘤等过程的调控。不仅如此，研究还发现miR-138能负性调控神经元内SIRT1的表述调控轴突的再生[8]。近来Zhang等人通过Western蛋白印迹及突光素酶报告基因验证了 SIRT1是miR-204的靴基因，通过负性调控其表述抑制胃癌细胞的侵袭力[9]。因此，从生物学水平验证SIRT1是miR-204调控惊厥性脑损伤后神经元调亡及突触可塑性的改变是目前急需要解决的问题。当前对勒基因进行验证应用最为广泛的是两种实验模型：一种是通过载入外源miRNAs制作过表述模型;另一种则是制作特异性miRNAs的沉默模型。前者通过人为增加细胞或组织内特异性miRNA的积聚，可能导致某些非生理性祀基因的抑制，不能完全体现miRNA对紀基因的真实调控；而后者若能尽量避免脱勒效应，在较大程度上能反映生理情况下影响IE基因表述水平。本实验将从两方面入手，通过体外瞬时转染miR-204 mimics / inhibitors,制作PC12神经元样细胞miR-204过表述及低表述模型，从细胞学水平验证SIRT1是iniR-204调控惊厥性及损伤过程的祀基因。不仅如此，本实验还将观察miR-204的不同表述对惊厥后PC12细胞的调亡及GAP-43改变，以期更形象地观察miR-204对神经元调亡及突触可塑性的调控。

总结

1、特异性miRNAs的表述异常参与了发育期惊厥性脑损伤的进程。本实验发现miR-34b-5p、-204、-582-3p、-672四者在惊厥后的大鼠海马及大脑皮质组织均具有异常表述，且这种差异性表述具有一定的组织特异性。2、惊厥性脑损伤在下调了神经元SIRT1表述的同时，上调裯亡相关因子p53的表述，进一步加剧了惊厥后神经元的调亡，抵制神经元轴突的生长与延伸，造成不可逆性脑损伤。3、miR-204是一种在中枢神经系统内具有广泛表述的miRNA，其在惊厥性脑损伤后表述较对照组显著上调，通过负性调控SIRT1的表述减少惊厥诱导的神经元凋亡，加速神经元轴突的生长与延伸，其机制与抑制其下游因子p53的蛋白表述关于，通过诱导其去乙酸化下调生理活性。参考文献（略）