孤雌胚胎干细胞来源的组织工程皮肤种子细胞的研究

第一章文献综述

1.1 ESCs的研究进展

胚胎干细胞是一类具有多潜能性的未分化细胞，在机体的生长和组织修复中发挥重要作用，并可以在合适的条件下能够在体外向多种细胞表型进行分化。研究表明，胚胎干细胞在体外能够被诱导成为多个胚层的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞、血细胞、神经细胞等。在这些研究基础上，学者们普遍认为干细胞是组织工程皮肤种子细胞的最佳来源之一。

1.1.1 ESCs和pESCs的研究发展1981年Evans等首次从囊胚的内细胞团分离出ESCs，具有增殖能力强和多潜能性等特征。随后，Thomson等利用人的囊胚建立了人的ESCs系。 Wang等曾用小鼠胚胎来源的MSCs诱导出内皮细胞, 2006年，日本学者amanaa研究了细胞的重编程技术，向成纤维细胞内导入4种生长因子Oct3/4, Sox2, c-Myc，使成纤维细胞恢复到ESCs的现实。到2021年，Ahmad等人报道，用人类的ESCs诱导出了神经样细胞并且能够产生神经递质，且能够产生动作电位。有研究显示，对ESCs进行长时间的体外培养，能够减小细胞在移植到体内后形成肿瘤的概率。据文献报道，ESCs适宜在有滋养层细胞或者有白血病抑制因子(Leuaemia inhibitor factor, LIF)的条件下生长，能够保持较好的未分化现实，且ESCs在低贴壁能力的培养皿中会聚集成团，形成EBs。在EBs分化的初期，EBs中的细胞逐渐表述外胚层和中胚层的基因，这与胚胎的发育过程一致。 Hwang等培养人胚胎干细胞形成EBs 10天后将EBs贴壁培养，用细胞刮将EBs迁移出的纤维样细胞分离并扩增，结果显示获得的细胞表述CD13, CD14, CD29等间充质干细胞表面抗原，即获得了MSCS。然而，获得ESCs的过程破坏了胚胎，这引起了道德和伦理角度的争论，限制了ESCs的研究和应用。.................................

1.2 TES的研究和进展皮肤是人体最大的器官，可以隔离机体和外部环境，在保护体液免于流失、体温调节和免疫防御中起重要作用。创伤、感染、肿瘤切除等造成的皮肤缺损，以及糖尿病、静脉曲张等造成的皮肤溃疡是临床上常见的疾病，损害了病人的身体健康和生活质量。目前针对皮肤缺损最常用的治疗方法仍然是自体皮肤移植。自体皮肤移植一方面皮肤来源有限，无法治疗大面积皮肤缺损，另一方面开辟第二术区会给患者造成了新的痛苦，并会导致皮肤供区的继发性畸形。TES的研究和发展为临床上治疗皮肤缺损提供了一种行之有效的方法。1.2.1 TES的发展和分类1975年，Rheinwald等成功培养人表皮细胞，自此以后，表皮细胞的培养得到了普及，为皮肤缺损的修复提供了可能。1981年，美国科学家Conner将培养的表皮膜片移植到2例烧伤患者身上，并修复了患者的创面。 1970年，美国Integra lifescience公司开发出永久性的TES真皮替代物Integra.1970年，美国公司研发出另一种无细胞的TES产品Alloderm. 1997年，美国Advanced tissue' science公司研发出活性人工真皮Transcyte.,在其中培养有新生儿包皮分离的成纤维细胞。1998年，美国Organogenesis公司研制出了一种TES Apligraph，其中培养了新生儿成纤维细胞，是具有双层结构的TES。 2001年，美国Advanced tissue sciences公司又生产出另一种人工皮肤Dermagraft真皮替代物，在其中培养有新生儿成纤维细胞综上所述，目前成熟稳重的TES可以分为无细胞的真皮替代物，有细胞的真皮替代物及含表真皮双层结构的皮肤替代物三种。............................

第二章pESCs和ESCs的扩增培养和特征检测

本实验假定TES种子细胞来源于pESCs和ESCs，因此需要进行扩增培养，获得足够数量的pESCs和ESCs才能进行接下来的实验。pESCs和ESCs具有扩增迅速、多潜能性等特点，作为TES种子细胞具有明显优势，在本实验中我们首先确认所培养的pESCs和ESCs具有上述多潜能性的特点。通过观察扩增培养中细胞的形态特点和生长现实，研究pESCs和ESCs的多潜能性特征，即通过细胞的免疫荧光鉴定其在体外培养时的多潜能性特征，通过畸胎瘤的HE染色鉴定其在体内向三胚层的分化能力，确定所培养的pESCs和ESCs具有多潜能性的特点，能够在体外进行定向诱导分化，这些实验对于奠定后续的实验基础，确定后续的实验方法具有重要意义。

2.1实验试剂胚胎干细胞培养液(ESGRO Complete PLUS Clonal Grade Medium, Millipore)、干细胞消化酶(Accutase, Millipore), IIVIEM培养液(Hyclone)、兔Nanog抗体(Santa Cruz)、小鼠SSEA-1抗体((Santa cruz)、山羊Oct 3/4抗体((Santa cruz)、兔抗山羊荧光二抗(Invitrogen)、山羊抗鼠荧光二抗(Invitrogen)、山羊抗兔荧光二抗(Invitrogen), Triton X-100(GeneTex), BSA(牛血清白蛋白，Merc), DAPI(4,6一二眯基一2一苯基叫噪，Roche):明胶(Sigma)、多聚甲醛(天津天力)、NaCI(MP), Cl(Amresco), Na2HPOa(Amresco),HZPOa(Amresco)、甘油((Sigma)、丝裂霉素C(Sigma)、石蜡(Leica)，其他国产化学试剂等。

2.2实验动物将免疫缺陷小鼠(购自第四军医大学动物中心)，喂养在无菌操作台中，每天定时加水喂食，每两天换一次垫料。....................................

第三章 pESCs和ESCs形.............. 24-323.1 实验试剂................. 243.2 实验仪器............... 243.3 实验器材 ..................24-253.4 主要试剂配................. 253.4.1 细胞扩增................. 253.4.2 PBS的配制................ 253.5 实验方法................... 25-273.5.1 EBs的形成........................ 253.5.2 EBs的贴壁.................... 25-273.5.3 结果统计...............273.6 实验结果 .....................27-303.6.1 EBs的免疫荧光................... 27-283.6.2 EBs的贴壁.................... 28-303.7 实验小结与讨................... 30-32第四章 MSCs多系分化................ 32-384.1 实验试剂................. 324.2 实验仪器.............. 324.3 实验器材................. 324.4 主要试剂............. 32-334.4.1 细胞扩增.................... 32-334.4.2 PBS的配制..................... 334.5 实验方法 .......................33-344.5.1 MSCs向成骨................... 334.5.2 MSCs多系分化.........................33-344.5.3 流式细胞仪检测................... 344.6 实验结果 ..................34-364.6.1 MSCs的观察 ..............354.6.2 MSCs多系分化............... 354.6.3 MSCs表面....................... 35-364.7 实验小结与讨论..................... 36-38.............................第六章TES的制备和移植实验

通过第五章的定向诱导实验，我们已经分别获得了pESCs和ESCs来源的成纤维细胞，分别称之为pESCs-d Fs和ESCs-d Fs。诱导获得的成纤维细胞都与小鼠成纤维细胞的性质类似，表述多种生长因子，且波形蛋白表述阳性。接下来，我们要借助动物模型的建立，用上述诱导获得的pESCs-d Fs和ESCs-d Fs充当种子细胞，分别构建胶原水凝胶TES，在小鼠背部进行皮肤缺损修复。记录皮肤缺损的愈合情况，计算皮肤缺损修复面积和修复率，统计显著性差异，并用HE染色的方法展示不同来源的种子细胞所构建的TES修复效果的差异。通过上述方法评价诱导获得的博SCs-d Fs和ESCs-d Fs充当TES种子细胞的效果，评估其是否能够充当种子细胞，以及与小鼠成纤维细胞在皮肤缺损修复效果方面的异同。

6.1实验试剂DM1rM高糖培养液(Hyclone), DMEM高糖培养液干粉(Gibco)、胎牛血清(Gibcoj,非必需氨基酸(Hyclone)、双抗(Hyclone) ,胰蛋白酶(Hyclone)、戊巴比妥钠(Sigma),CFDA(Sigma), Na.HC03(Amresco), NaaS(天津天力)、多聚甲醛(天津天力)、石蜡(Leica)、医用酒精，其他国产化学试剂等。..........................

结论本文将pESCs和ESCs引入作为TES的种子细胞来源，提供了一种新的获得TES种子细胞的方法，尤其是pESCs，未见有相关文献报道。根据本文上述各项实验，我们得到了以下结论:(1) pESCs和ESCs在体外均可以正常扩增，细胞生长成圆形集落状，在体外全能型基因和未分化现实标志基因的表述很强，保持了较好的未分化现实;在体内可以分化为各个胚层的组织，形成畸胎瘤。(2)对EBs的的基因表述状况进行了检测。在EBs的培养的第10天，对其进行石蜡包埋，荧光染色，结果显示CD31, CD34, CD73和CD151己经开始表述，说明细胞已经处在分化现实;在EBs贴壁培养的过程中逐渐有梭形细胞从EBs的边缘迁移出来，并且伸展面积越来越大;在EBs贴壁培养的不同天数，收集RNA进行实时定量PCR的检测，结果显示外胚层基因Nestin，中胚层基因Snaill, handl皇GATA2，内胚层基因AFP随着培养时间的延长渐次表述，并且全能基因Oct 3l4的表述一直在降低。(3)获得了具有典型特征的MSCs。收集EBs外围的细胞进行扩增培养，MSCs的表面抗原包括CD29, CD44和CD73等，流式细胞仪检测的结果显示阳性表述上述基因的细胞比例均达到要求;对所获得的细胞进行多系分化能力检测，证明细胞可以向骨、软骨和脂肪方向分化，更进一步证明所获得的细胞就是MSCso(4)诱导MSCs向成纤维细胞分化，获得了具有成纤维细胞特征的细胞。用CTGF诱导MSCs向成纤维细胞分化，在诱导的不同阶段收集细胞的RNA和总蛋白，分别用实时定量PCR和ELISA方法检测生长因子，生长因子的表述都呈现山峰;状即上升后下降的趋势，并且有些生长因子的表述要高于成纤维细胞，这说明诱导具有很好的效果;CD73阳性表述证明了细胞的中胚层属性。

参考文献（略）