红斑丹毒丝菌新型毒力相关因子鉴定及其耐喹诺酮药物医学机制初探

第一章 文献综述1.1 红斑丹毒丝菌研究进展1.1.1 病原学红斑丹毒丝菌是一类小的革兰氏阳性杆菌，菌体细长，单个或成链状存在(Brooe and Riley, 1999)。十九世纪首次发现该病原能感染人，其感染人导致三种症状，包括：局限性皮肤损伤、类丹毒（广泛的皮肤损伤，为了区别链球菌导致的丹毒）、伴随心内膜炎的败血症(Gorby and Peacoc, 1988)。该病原能感染多种野生动物、家养动物、鸟类和鱼类。红斑丹毒丝菌感染猪导致的猪丹毒最为普遍且造成了很大的经济损失。该病原感染火鸡、鸡、鸭导致丹毒，感染绵羊、小羊导致多发性关节炎。红斑丹毒丝菌感染鱼导致未知的疾病，其能在鱼外部的粘液蛋白中存活很长时间。红斑丹毒丝菌感染人跟职业关于，跟感染动物，动物制品或被污染的排泄物、土壤等接触的人易感。人感染红斑丹毒丝菌后最常见的症状是类丹毒，一些其他的名称也用来描绘该症状，包括：鲸手指、斑点手指、肿手指、鱼中毒、猪肉手指等(Reboli and Farrar, 1989)。然而，部分红斑丹毒丝菌感染病例可能并没有得到正确诊断，因为其症状与其他感染类似，分离与鉴定也会遇到一些困难(Dunbar and Clarridge,2000)。红斑丹毒丝菌不同菌株间血清型、生化性质、抗原差异都十分大。Taahashi 等研究了分离于健康的屠宰猪体内的红斑丹毒丝菌，发现这些菌株属于 6 个不同血清型(Taahashi et al., 1987b)。致病性检测显示 2、6、11、12、16 型血清型菌株对小鼠具有很高的致病性，尤其是 2 型菌株。与其他血清型相比，血清 7 型菌株的 LD50值十分高，这些无毒的 7 型菌株主要分离于猪的扁桃体。随后 DNA-DNA 同源研究发现 7 型菌株在遗传学上明显不同于红斑丹毒丝菌(Taahashi et al., 1992)，这些菌株形成了一个新的种属：扁桃体丹毒丝菌。在该研究中，血清 13 型，18 型菌株与红斑丹毒丝菌和扁桃体丹毒丝菌的杂交率十分低，提示这两个血清型可能属于新的种属。最初认为扁桃体丹毒丝菌的形态学和生化性质与红斑丹毒丝菌的完全一致，之后证实扁桃体丹毒丝菌能发酵蔗糖而红斑丹毒丝菌不能(Taahashi et al., 1992)。Taahashi 等人分析了 1958-1996 年间世界范围内来源于急性或慢性丹毒症状的猪或其他健康（或感染）动物以及环境材料的 93 株丹毒丝菌，发现 96 %的扁桃体丹毒丝菌是无致病力的，而 66 %的红斑丹毒丝菌对猪致病。..........1.2 蛋白质组学技术及应用蛋白质组（proteome）的概念最初由 Wilins 等人于 1994 年在第一届国际二维电泳会议上提出。随后 Wasinger 等人于 1995 年在 Electrophoresis 杂志上提出了蛋白质组的定义：一个基因组编码的全部蛋白质(Wasinger et al., 1995)。1997 年，Wilins和 Wiliams 编著的《蛋白质组研究：功能基因组学中的新尖端领域》一书对蛋白质组定义为：一个基因组或组织所表述的全部蛋白质。1999年蛋白质组的定义完善为：在一个细胞的整个生命过程中由基因组表述的以及表述后修饰的全部蛋白质。因此，目前认为蛋白质组的含义是一个细胞、一类组织或是一种生物的基因组所表述的全部蛋白质。蛋白质组学是研究细胞、组织或生物体蛋白质组的组成及其变化规律的科学，旨在阐明生物体全部蛋白质的表述模式及功能模式。蛋白质组学的含义和传统生物化学中的蛋白质化学有很大区别。传统的蛋白质化学着重于单一蛋白质结构、功能的研究，例如某一种蛋白质或蛋白质亚基的全序列分析，三维立体结构的确定，这样的结构如何执行功能，在生理上所扮演的角色，以及代谢的生物化学机制等。蛋白质组学则是研究多种蛋白质组成的复杂系统，其研究对象是多种蛋白质混合物的系统行为;，而不是单一组成;的行为。它通过对一个大系统（如生理或病理现实下的特定的通路、细胞器、细胞、组织、器官或机体）中所包含的所有蛋白质进行分离、鉴定、表征和定量，提供对于该系统准确和全面的数据和信息。蛋白质组学研究策略包括四个部分：蛋白质分离策略、蛋白质图谱分析、蛋白质鉴定和蛋白特性分析。涉及到四个关键技术平台：样品的制备（应用二维凝胶电泳、单项凝胶电泳、亲和捕获等进行纯化分离和分析）；获取蛋白质信息（应用质谱法、降解成肽段）；蛋白质鉴定（应用生物信息学）及细胞图谱分析（蛋白质-蛋白质相互作用、二维结构、细胞定位、翻译后修饰（posttranslational modifications,PTMs））。..........第二章 红斑丹毒丝菌比较蛋白质组学研究2.1 前言猪丹毒主要引起猪的败血症、心内膜炎和多发性关节炎等，大多数发生于 3 月龄以上的猪和怀孕母猪，其流行具有一定的季节性，以炎热多雨季节流行最盛。猪丹毒病原体为红斑丹毒丝菌（俗称猪丹毒杆菌），该菌最主要的储存宿主为猪，也是鸟、鱼和家养动物及人类的致病菌。猪丹毒的病原体不仅见于感染病猪，在健康的猪体中也广泛存在。猪丹毒广泛存在于世界各地，其中，北美、欧洲、亚洲和澳大利亚比较常见，是对养猪业影响较大的疾病之一。美国农业食品安全与检测部将猪丹毒列为导致猪死亡的十大疾病之一。在我国也曾出现过猪丹毒的大流行，1952 年，湖南岳阳曾经爆发过猪丹毒。据统计，193 个乡镇、1311 个村发病，猪的死亡率达到 68.3 %。上个世纪 90 年代，我国的猪丹毒得到控制。然而 2021 年以来，猪丹毒在我国部分省市发生流行。2021年，猪丹毒病例已逐渐增多。至 2021 年，在我国湖南、湖北、江西、广西、四川、广东、浙江等多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行，给猪场造成了巨大的经济损失。猪丹毒老病新发，然而其病原红斑丹毒丝菌的致病机制并不清楚，这严重影响了猪丹毒的防控工作。揭示红斑丹毒丝菌致病机制成为当前需要迫切解决的问题。系统性鉴定红斑丹毒丝菌毒力因子有助于阐述红斑丹毒丝菌致病机制。鉴于革兰氏阳性菌的细胞壁相关蛋白在细菌的粘附、侵入等致病过程中发挥重要作用，本研究以红斑丹毒丝菌的细胞壁相关蛋白为研究对象，利用 iTRAQ 结合LC-MS/MS 的方法鉴定强弱毒菌株差异表述的细胞壁相关蛋白。强毒菌株中高表述的细胞壁蛋白可能跟细菌致病力相关。本研究系统性鉴定的潜在的红斑丹毒丝菌毒力相关因子将为毒力因子研究提供依据，进而为揭示红斑丹毒丝菌致病机制奠定基础。........2.2 材料与方法临床分离的红斑丹毒丝菌均分离自发病猪场，大部分菌株分离自发病猪，少数分离自未表现明显症状的猪。红斑丹毒丝菌在 TSA 或 TSB 中 37 ℃培养（含 10 %的新生牛血清）。BCN-1360 生物洁净工作台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；PCR 仪（北京东胜实业有限公司）；恒温水浴锅（北京六一仪器）；小型高速离心（德国 Eppendorf公司）；大型高速离心机（CR21G Ⅲ日本 Hitachi 公司）；-20 ℃立体冰箱（德国西门子公司）；-80 ℃立体冰箱（中国海尔公司）；紫外凝胶成像系统（上海嘉鹏科技有限公司）；超声波破碎仪（美国 Ultrasonic Processor 公司）；蛋白纯化仪（瑞典安马西亚公司）；全自动酶免工作站（美国 TECAN 公司），紫外分光光度计（美国 BIRAD 公司）；大振幅恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有限责任公司）；立式高压灭菌锅（上海博讯实业有限责任公司）；电泳仪（DYY-81，北京六一仪器）。电泳、转膜装置（美国 Bio-Rad 公司）；蛋白纯化仪（美国 GE Healthcare 公司）；Q-Exactive 质谱仪（Thermo Finnigan）；ATA Purifier 100 纯化仪（GE Healthcare）；低温高速离心机（Eppendorf5430R）；可见紫外分光光度计（尤尼柯 WFZ UV-2100）；真空离心浓缩仪（EppendorfConcentrator plus）；600 V 电泳仪（GE Healthcare EPS601）。.........第三章 鉴定红斑丹毒丝菌新型毒力相关因子 Sbp.....423.1 前言......423.2 材料与方法..........423.3 结果 ..... 543.4 讨论 ..... 643.5 结论 ..... 66第 4 章 临床分离的红斑丹毒丝菌耐药性分析及其耐喹诺酮类药物........... 674.1 前言 ..... 674.2 材料与方法 ......... 674.2.1 菌株 ........... 674.2.2 主要试剂 ........... 674.2.3 主要缓冲液以及培养基的配制 ....... 684.2.4 主要仪器设备 ........... 684.2.5 红斑丹毒丝菌临床分离株的耐药性分析 ....... 684.2.6 E-test 药敏纸条检测红斑丹毒丝菌环丙沙星和左旋氧氟沙星 MIC 值..... 694.2.7 引物设计与合成 ....... 694.2.8 目的基因的 PCR 扩增...... 704.2.9 构建点突变载体 ....... 704.3 结果 ..... 714.4 讨论......784.5 结论......805 总结.........81第 章 临床分离的红斑丹毒丝菌耐药性分析及其耐喹诺酮类药物的分子机制初探4.1 前言在 80 年代末和 90 年代初，猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病，曾经给我国养猪业造成严重的经济损失。然而随着规模化养猪和机械化养猪的发展，猪丹毒似乎逐渐淡出了人们的视线，急性典型的临床病例在规模化猪场的发生比例越来越低，很多规模化猪场已经停止使用猪丹毒疫苗。据农业部公布的 2021 年 1-4 月份农业部全国生猪疫情显示，猪丹毒在广西猪群感染病例分别是 41、124、202、179，致死病例 10、14、55、28；在四川猪群感染病例分别是 72、38、31、86，致死病例 13、13、9、13；猪肺疫在广西猪群感染病例分别是 108、235、360、322，致死病例 25、33、84、54；在四川猪群感染病例分别是 32、71、59、22，致死病例 10、30、19、10。此外在贵州、重庆、云南等地亦发生猪丹毒肺疫等不同程度的疫情。自 2021 年以来，我国湖南、湖北、江西、广西、四川、广东、浙江等多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行。农业部 2021 年发布的全国生猪疫情报告显示：猪丹毒病例数远高于猪瘟、高致病性蓝耳病、猪囊虫病、炭疽、猪肺疫及布鲁氏菌病,给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究分析了 41 株临床分离的红斑丹毒丝菌的耐药性，对规范使用抗生素防控猪丹毒提供了科学指导。

.........总结红斑丹毒丝菌感染猪导致猪丹毒，主要引起猪的败血症、心内膜炎和多发性关节炎。2021 年以来，我国多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行，给猪场造成了巨大的经济损失。虽然红斑丹毒丝菌成为严重危害养猪业的传染病病原，但对于其致病机制和免疫机制的研究还相对滞后。红斑丹毒丝菌的致病机制不明确成为防控猪丹毒最大的阻碍，新毒力（相关）因子及毒力调控基因的发掘以及功能研究是目前红斑丹毒丝菌致病机理研究的关键。本研究力图系统性发掘红斑丹毒丝菌新的毒力（相关）因子,为进一步研究红斑丹毒丝菌致病机制提供研究基础。同时对猪丹毒临床分离菌株进行了耐药谱检测，以期给临床防止猪丹毒提供用药指导。在发现红斑丹毒丝菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药率高且呈现 MIC 值多样性后，本研究对红斑丹毒丝菌耐喹诺酮类药物的机制进行了初步探索。取得了如下结果：（1）以 BALB/c 小鼠和仔猪为动物模型，对临床分离的红斑丹毒丝菌进行致病力检测，确定 CY0160 为强毒菌株，GW1020 为弱毒菌株，对这两株菌进行 MLST 分析发现：CY0160 和 GW1020 同属 ST48 型。以这两株菌的细胞壁蛋白质为研究对象，进行了比较蛋白质组学研究，共鉴定到 100 个差异表述蛋白，其中强毒菌株中高表述蛋白为 57 个，主要是 ABC 转运蛋白和粘附相关蛋白；强毒菌株中低表述蛋白为 43个，主要为压力反应蛋白。（2）iTRAQ 鉴定到 Sbp 蛋白在强弱毒菌株差异表述倍数为 1.73，Western Blot验证结果与 iTRAQ 结果一致。本研究构建了 sbp 基因缺失突变菌株，与野生菌株相比，Δsbp 粘附侵入宿主细胞的能力降低，抵抗全血杀伤的能力也显著降低。动物感染模型证实 Sbp 是红斑丹毒丝菌的新型毒力相关因子。（3）鉴于致病菌表面的某些毒力相关因子同时也是其重要的保护性抗原。本研究制备了 Sbp 亚单位疫苗，通过仔猪模型评价了抗体水平和疫苗保护效力，证明 Sbp是红斑丹毒丝菌有效的疫苗侯选蛋白。（4）对临床分离的红斑丹毒丝菌进行了耐药谱检测，从耐药率来看，当前最适宜防控红斑丹毒丝菌的药物依次是：β-内酰胺类、林可酰胺类和四环素类。..........参考文献（略）