组织蛋白酶K在牙体硬组织形成中的医学作用研究

前 言牙体硬组织包括牙釉质、牙本质和牙骨质，和骨组织同为人体硬组织，尽管功能迥异，但是它们在结构和组成上却有诸多相似之处。在牙冠形成的早期，牙釉质便已经开始形成。首先成釉细胞分泌几乎全部由蛋白质组成的釉质基质，此后釉质不断矿化，釉质基质被降解并吸收，最后当釉质矿化成熟稳重后其矿化程度可达到 95%以上。因此釉质的形成与釉质基质中蛋白的降解和吸收密切相关。目前公认的由成釉细胞分泌并在釉质形成中发挥作用的蛋白酶只有两种，即基质金属蛋白酶 20（matrix metalloproteinase 20，MMP20）和激肽释放酶 4（allirein 4，L4）。然而，据文献报道，并不是所有釉质发育不全的表型都是由MMP20、L4 或釉基质蛋白基因突变所导致，这就提示存在其他釉质相关蛋白酶参与釉质形成的可能性。本课题组前期研究和以往的文献报道均证实组织蛋白酶 （cathepsin ，CTS）基因突变导致致密性成骨不全的患者常表现出釉质发育不全，因此我们推测 CTS 可能在釉质的形成中亦发挥作用。牙本质是与骨组织最接近的牙体硬组织成分。前期牙本质形成之后，基质蛋白的降解和修饰过程启动，最终完成基质矿化，形成成熟稳重的牙本质。这一过程与骨形成过程极其相似。考虑到牙本质和骨组织有着相似的物理性质和组成成分，而且致密性成骨不全的患者常常表现出牙髓腔消失、根管闭锁等牙本质异常的表现，因此在骨改建过程中发挥关键作用的 CTS 可能在牙本质的形成和重建中发挥作用。覆盖在牙根表面的牙骨质是一种特殊的矿化结缔组织，其矿化过程与骨组织相似，同时致密性成骨不全的患者有一个典型的症状就是牙骨质增生，因此 CTS 也很可能参与了牙骨质的形成。本研究中我们利用免疫组化染色观察不同发育阶段的小鼠磨牙牙胚和磨牙中CTS 的表述情况，通过酶谱实验和体外降解实验对 CTS 降解釉原蛋白等釉基质蛋白的能力进行检测，构建 Cts 基因敲除小鼠模型并初步观察了其下颌骨及牙齿的形态和结构，同时结合 CTS 基因突变临床病例的研究，来探索 CTS 在牙体硬组织形成中的作用，希望能够揭示 CTS 的新功能及解释致密性成骨不全的发病机理。.........文献回顾1995 年，Inaoa 等[1]利用克隆技术在兔破骨细胞中发现一种新的半胱氨酸蛋白酶，命名为组织蛋白酶 （cathepsin ，CTS），并且利用兔组织蛋白酶 的 cDNA片段作为探针，从人髋关节炎的 cDNA 文库中克隆出人组织蛋白酶 ，其与兔组织蛋白酶 有 94%的同源性。1996 年，Gelb 等[2]通过基因检测证明致密性成骨不全的病因为 CTS 基因突变，该疾病的遗传方式为常染色体隐性遗传。致密性成骨不全患者常表现出身材矮小、骨密度增高、频发骨折、锁骨发育不良、指/趾骨末端溶骨等典型的骨骼异常[3-6]。此外，还会表现有牙釉质发育障碍、髓腔或根管闭锁以及牙骨质增厚等牙体硬组织异常[7-13]，但其机制尚不清楚，迄今为止尚未见到 CTS 在牙齿发育过程中表述模式及作用的研究报道。1组织蛋白酶CTS 由位于人类 1 号染色体长臂 2 区 1 带的 CTS 基因编码[14, 15]。CTS 基因序列全长约 12.1 b（GenBan acc. no., NC_000001.10），由 8 个外显子和 7 个内含子组成（GenBan acc. no., NM_000396.2）。起始密码子位于 2 号外显子，终止密码子位于 8 号外显子。和大部分蛋白酶一样，CTS 在细胞中是以没有活性的 CTS 酶原的形式被合成和分泌。CTS 酶原是一条未糖基化的单链（Gen Ban acc. no.，NP_000387.1），分子量为 38 D，分为信号肽区、前肽区和酶活性区三部分，共由 329个氨基酸残基序列组成（图 1-1）[16, 17]。通过氨基酸序列的比对发现，活化的 CTS与组织蛋白酶 L 有 76%的相似性，与组织蛋白酶 B 有 58%的相似性，但是这些酶原的前肽区并没有显著的同源性[18]。CTS 酶原的信号肽由 15 个氨基酸残基序列组成，其主要功能是引导酶原跨膜转运至内质网，而后水解脱离酶原。此时酶原的前肽部分折叠，充填并阻挡了酶活性区底物结合部位的暴露，因此蛋白酶并不具有活性[19]。在酸性环境下，CTS 酶原可以催化自身发生蛋白水解，去除其 N 端由 99 个氨基酸残基序列组成的具有 3 个螺旋结构的前肽区，暴露出组氨酸-半胱氨酸功能区，从而被活化[20]。活化的 CTS 含有 215 个氨基酸残基，三维结构近似左右对称的V;型，其功能位点 Cys25 残基和 His159 残基位于中间的沟槽内。在酸性条件下，Cys25残基的巯基被 His159 残基的咪唑基团极化，两个残基结合成离子对，离子对中被极化的巯基能够与胶原蛋白的羰基结合而发生酰基化，再通过去酰基化过程使胶原蛋白降解（图 1-2）[16, 19, 21-23]。有研究表明，活化后的 CTS 其酶活性区的结构与活化前几乎一致[24]。.........1.2组织蛋白酶的功能1.2.1组织蛋白酶在骨吸收过程中的功能在骨吸收陷窝的酸性环境中，CTS 可以降解骨基质蛋白中的Ⅰ型胶原（collagentype I，COL1）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和骨连接蛋白（osteonectin，ON）[4,23, 25-27]，但 CTS 的功能异常只会造成有机基质的代谢异常，并不会改变骨吸收陷窝的酸性环境，也不会影响无机质的吸收[28]。在破骨细胞分化的全过程中，都能够检测到 CTS 的表述，是骨吸收过程中的关键酶。CTS 可以通过其降解胶原产生的产物调控破骨细胞的活性，当降解产物在骨吸收陷窝达到一定浓度时，可以抑制破骨细胞与骨基质的结合，减缓甚至终止破骨细胞的骨吸收进程。而近年来研究表明，利用 CTS 抑制剂可以治疗如骨质疏松等由于骨吸收异常引起的疾病[29]。1.2.2组织蛋白酶在免疫系统中的功能有报道称因 CTS 基因突变而患致密性成骨不全的患者，其单核细胞功能测试显示细胞吞噬能力正常，而杀伤功能受损，同时白细胞介素-1 的分泌功能也受到损害[30]。发表在 Science 杂志上的一项研究表明，CTS 抑制剂能有效地抑制关节的自身免疫性炎症及其导致的骨吸收，阻断或抑制 CTS 功能可导致 Toll 样受体 9 的缺陷，使非甲基化的 CpG DNA 片段（非特异性免疫刺激剂）无法正常激活树突状细胞分泌辅助性 T 细胞 17，但不影响树突状细胞的抗原提呈能力，而且 Cts 基因敲除小鼠患自身免疫性脑脊髓炎的严重程度明显降低[31]。这些研究提示，CTS 在免疫系统中起着重要的作用，可以作为治疗自身免疫性疾病的一个有效靶向。........第三部分 CTS基因敲除小鼠的构建及其牙齿形态结构的初步观察.............501 材料.....501.1 伦理审查 .....501.2 实验动物 ............501.3 主要试剂 ............501.4 主要设备 ............512 方法.....512.1 Cts-/-小鼠的繁育.........512.2 小鼠基因组 DNA 提取及基因型鉴定....523 结果.....543.1 Cts 基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定..............543.2 Cts 基因敲除小鼠下颌骨及牙齿形态的大体观察 ......553.3 Cts 基因敲除小鼠牙齿形态结构的 Micro CT 扫描 .............564 讨论.....57第四部分 CTS 基因突变导致致密性成骨不全的个案研究.............611 病例简介..............612 临床检查..............622.1 颌面部检查 ...........622.2 全身检查 ............633 影像学检查及其他辅助检查......644 基因诊断及家系分析.........665 讨论.....71第四部分CTS基因突变导致致密性成骨不全的个案研究目前，通过基因诊断确诊为致密性成骨不全的病例在国内鲜有报道[175]。曾经有一位在外院被诊断为骨硬化症长达 30 年之久的患者，因为拔牙后创口不愈合伴感染来我院就诊，经过详细的临床及影像学检查，并通过基因诊断确诊为致密性成骨不全[74]。时隔七年，又有一名患者因拔牙创感染不愈来我院就诊，该患者与先前在我院确诊为致密性成骨不全的患者有着相似的全身和口腔颌面部表征。本研究在为该患者明确诊断的基础上，对前期的研究结果进行验证，并进一步明确该疾病的临床诊断要点，为该类疾病的诊疗积累经验。患者于 1 年 2 个月前拔除左下后牙，术后出现牙槽突肿胀、疼痛、溢脓，于当地医院诊断为左下颌骨骨髓炎;，并予抗炎治疗后（螺旋霉素、甲硝唑，具体用量不详），症状缓解，但停药后即复发。1 年来患者断续自行服药抗炎治疗（螺旋霉素、甲硝唑，具体用量不详），但拔牙创口一直不能愈合。半月前于当地医院行骨髓炎刮治术;，术后肿痛症状改善不明显，遂来我院就诊。........小 结1)通过免疫组化染色首次发现：在小鼠磨牙牙胚发育过程中，分泌期到成熟稳重晚期的成釉细胞均表述 CTS，表述强度呈弱-强-弱的变化；在牙本质矿化阶段，分泌期的成牙本质细胞强表述 CTS，并且这种表述一直持续到牙本质形成的晚期；2)通过酶谱实验和体外降解实验首次发现：CTS 能够在体外降解釉原蛋白等釉基质蛋白；3)初步观察到 Cts-/-小鼠磨牙具有釉质发育不全、局部髓室闭锁等牙体硬组织异常表现。结论和意义：本研究发现了 CTS 能够降解釉原蛋白等牙体硬组织代谢相关蛋白的新功能；找出了 CTS 在牙齿发育过程中可能的作用底物；首次揭示了 CTS 在小鼠磨牙发育过程中的时空表述模式；成功构建了 Cts-/-小鼠模型，初步观察到 Cts-/-小鼠的牙体硬组织异常表现；提出了 CTS 通过在釉原蛋白、Ⅰ型胶原等基质蛋白的降解中发挥作用，进而参与牙釉质、牙本质矿化及形成的新观点，为进一步研究其在牙齿发育中的作用机制、解释致密性成骨不全患者牙体硬组织异常的致病机理奠定基础。..........参考文献（略）