杜仲提取物对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制初探
前言
近代肝脏外科的快速发展得益于肝血流阻断技术的进步，控制术中出血有利于手术的顺利进行且降低术后并发症的发生及死亡的风险，但肝脏血流阻断无法避免的伴随着另一严重并发症的发生，即肝脏缺血再灌注损伤，特别是同时合并有肝硬化、术前肝功能较差或术前准备不足的患者，术后出现肝脏功能障碍或肝衰甚至死亡的可能性将大大增加[1-2]。因此，如何有效防治肝缺血再灌注损伤一直是肝脏外科发展过程中必须面对的一个热点问题。肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfasion injury,HIRI)是指肝血流中断后，肝脏组织和细胞处于供氧不足的现实维持一段时间再恢复其血流灌注，此时肝组织的功能障碍相比之前不仅没有得到有效缓解，反而发生更为严重的组织代谢障碍和结构破坏，从而导致器官功能障碍及其他并发症发生的现象。根据目前对 HIRI 的研究，氧化应激反应所产生的大量氧自由基可以直接损伤肝细胞膜，同时也可损伤肝窦内皮细胞引起微循环障碍[3]。另一方面，upffer 细胞、中性粒细胞等多种炎性细胞可在 HIRI 过程中被激活而引起一系列炎症反应，也可通过与内皮细胞的相互作用破坏肝组织正常结构，同时释放多种炎性细胞因子介导肝细胞损伤和进一步加重氧化应激反应[4-5]。因此，氧化应激和过度炎症反应都是导致肝脏损害的主要机制之一，通过抑制 HIRI 过程中的炎症反应和氧化应激可以有效减轻肝脏损害[6-8]。最新研究发现，高迁移率族蛋白 B1(high-mobility group protein B1, HMGB1)在介导 HIRI 过程中扮演重要角色[9]。HMGB1 是一种高度保守的 DNA 结合蛋白，正常情况下与 DNA上的小沟槽疏松结合，具有稳定核小体结构、调控转录因子与 DNA 相应序列结合的功能。组织损伤时，HMGB1 可由组织细胞或激活的免疫细胞主动分泌、或由坏死细胞被动释放至细胞外，作为内源性危险信号激活机体免疫系统，介导炎症反应[10]。研究表明，在肝缺血再灌注早期，肝实质细胞便主动分泌 HMGB1 至血液循环中，鼠缺血 60min 再灌注 60min 时，血浆 HMGB1 已急剧升高[11]，鉴于 HMGB1 在 HIRI发生发展过程中的关键作用，研究者们已将其视为治疗缺血再灌注损伤的一个潜在靶标[12]。目前针对 HIRI 的有多种防治方法，药物预处理便是其中之一。药物预处理是通过药物某些活性成分的药理作用，提前触发细胞抗炎、抗氧化反应机制，以增强肝组织对缺血、缺氧环境的耐受，减少 HIRI 时组织、细胞的损伤，从而起到有效的保护作用[13]。药物预处理因其操作简易、安全阈大且应用方便，已成为目前防治 HIRI研究的热门方向[14]。目前实验研究证明对 HIRI 具有保护作用的西药包括自由基清除剂、钙通道阻滞剂、upffer 细胞活化抑制剂和改善微循环的药物等[15-16]。但上述药物在保护肝功能的同时也存在较多毒副作用，因此绝大多数未能应用于临床，近年来随着中草药预处理在 HIRI 中防治作用的深入研究，我国学者发现某些中草药含有对 HIRI 具保护效应的成分并且无毒副作用，能够从多层次、多靶点影响 HIRI 的发生发展过程，抑制氧化应激反应、减少多种炎性介质的释放、抑制细胞调亡等[17]，从而减轻肝细胞损伤。如丹参能通过对钙离子通道的调节而维持膜内外钙离子的动态平衡，减少 HIRI 时细胞内钙超载现象，进而避免了 upffer 细胞的激活而释放大量毒性介质[18]；而姜黄素能够通过抑制中性粒细胞浸润，减少氧自由基产生和多种蛋白水解酶的释放，对 HIRI 起到有效的保护作用[19]；上述药物虽有实验研究证明其对 HIRI 有保护作用，但效果并不显著，目前尚无中药类成品药物用于临床防治 HIRI。
......
1 材料与方法
1.1 实验动物雄性 SD 大鼠 50 只，SPF 级，体重 280-350 克，由第三军医大学医学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCX（渝）2021-0005。饲养于遵义医学院中心实验室动物室内，室温 22℃-26℃，明暗各 12 小时。
......
1.2 实验用药杜仲水提物购自陕西瑞康生物工程有限公司。（提取浓度：1:10）乌司他丁购自广东天普生化医药股份有限公司。
......
1.3 主要试剂及仪器设备主要试剂及仪器设备详见表 1。
......
前 言 7材 料 与 方 法 1 0结 果 1 5讨 论 2 0结 论 2 4参 考 文 献 3 6
4 讨论
HIRI 常发生于多种肝脏外科手术过程中，此损伤是术后肝功能异常、原发性移植肝无功能、多器官功能衰竭的重要原因[27-28]，因此如何防止 HIRI 一直是肝脏外科研究热点，大量实验研究表明多种西药预处理可明显改善 HIRI。但由于多数药物毒副作用较大，影响它们在临床上的应用，中药在我国有两千多年的历史，由于其具有安全范围广，毒副作用小等优点，开发对 HIRI 具有保护作用的中药是目前研究的热点。杜仲为贵州道地药材，具有保肝护肾、抗炎抗氧化等广泛药理作用，有文献报道杜仲提取物对兔心肌缺血再灌注损伤及大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用[25]，但其对 HIRI 是否具有相同作用目前尚不清楚。本课题通过建立大鼠 HIRI 模型，应用不同浓度杜仲提取物对其进行预处理，研究杜仲提取物对 HIRI 的保护效应，并对其保护机制进行了初步探讨。
4.1 杜仲提取物对大鼠 HIRI 的保护效应HIRI 的发生是由多种机制相互影响，共同作用所导致的结果，最后引起肝细胞功能障碍、组织结构破坏，光镜下表现为大量肝细胞坏死、水肿，正常排列被打乱，肝索排列不规则，大量炎性细胞浸润等。组织病理学检查是判定肝组织结构是否受损的常用方法，本实验大鼠肝脏组织经 HE 染色，镜下观察见:与 IR 组相比,杜仲提取物预处理可减轻中央静脉和肝血窦的扩张及淤血，肝细胞变性和坏死减少，虽然汇管区仍有少量中性粒细胞浸润，但肝细胞排列整齐，肝索结构正常。可见杜仲提取物可明显缓解缺血再灌注损伤所致的肝组织、细胞的病理损害。机体血清 ALT 和AST 水平是反应肝细胞功能和组织细胞损伤程度的敏感指标。本实验结果显示，在缺血 1h 再灌注 4h 后，杜仲提取物预处理各组 ALT、AST 水平较 IR 组显著降低。提示杜仲提取物可改善缺血再灌注所致的肝细胞功能损伤。本实验结果显示杜仲提取物可明显改善HIRI模型大鼠的肝脏组织结构破坏及功能损伤，具有对 HIRI 的保护效应。
......
4.2 杜仲提取物对大鼠 HIRI 保护作用的机制探讨4.2.1 杜仲提取物对大鼠 HIRI 氧化应激指标的影响在缺血缺氧条件刺激下，uffer 细胞、中性粒细胞等经黄嘌呤氧化酶系统、吞噬细胞系统和线粒体三个途径产生大量氧自由基，过量的氧自由基可通过氧化细胞膜，改变其通透性，影响正常细胞代谢；氧化肝细胞内重要酶蛋白分子结构上的巯基，使酶丧失活性；破坏细胞 DNA 双链等方面导致肝细胞结构功能损伤[29-31]。可见氧化应激是 HIRI 的重要机制之一，在其发生发展的整个过程中均发挥重要作用。因此抑制氧化应激反应、减少氧自由基的产生，可对 HIRI 起到保护作用。MDA 是脂质过氧化反应的主要产物，其含量的高低与细胞内氧化应激反应相关，通过测量其浓度可间接了解细胞的氧化应激损伤程度。Hsieh CC 等[32]研究结果显示，正常肝脏 IR 组所测得 MDA 水平明显高于假手术组，说明 HIRI 过程中的确有细胞脂质过氧化反应机制的参与。本研究结果显示，IR 组的 MDA 含量高于假手术组，经杜仲提取物预处理的各组大鼠肝脏组织 MDA 含量明显低于 IR 组，说明术前应用杜仲提取物预处理能够减轻脂质过氧化反应，降低 MDA 含量，对大鼠肝脏 IR 损伤起到保护作用。
......
5 结论
本研究将乌司他丁预处理设为乌司他丁组，与杜仲提取物预处理组进行比较，观察杜仲提取物对 HIRI 保护作用强弱，结果显示：相比 IR 组，杜仲预处理各组对HIRI 均有明显保护作用（P＜0.05）,其中以杜仲-2 组、杜仲-3 组作用更为明显（P＜0.05），但各杜仲预处理组保护效应均未达到乌司他丁组相同水平（P＜0.05）。分析其原因，本次实验所用杜仲提取物为粗提物，对 HIRI 的保护效应源于其中某一种或几种成分仍未能明确，单独提取其有保护效应的活性成分用于 HIRI 防治是否能获得更好的结果有待进一步研究。
......
参考文献（略）