利伐沙班对兔颈静脉血栓模型血栓形成的影响及其抗凝相关实验室检测
前 言
血栓性疾病的治疗主要包括抗血小板和抗凝治疗，肝素、华法林等传统抗凝药物被广泛用于预防和治疗血栓性疾病。华法林作为老一代口服抗凝药，临床应用时间较长，疗效确切，但是存在治疗窗窄、需频繁监测、个体间剂量-效应差异性大、起效慢、作用消失慢、易与食物药物相互作用等诸多缺点[6]，导致患者依从性差，临床应用不便。近来，多种作用于凝血途径特定凝血因子的抗凝新药被研发，其中之一包括利伐沙班。众所周知，FXa 是凝血途径的关键酶，是内源性和外源性凝血共同通道的上游交点，而利伐沙班是一种口服的特异性 FXa 抑制剂，能高度选择性抑制 FXa 活性（与FXa 的结合力是其他丝氨酸蛋白酶的 10000 倍），从而阻断内源性和外源性凝血途径，抑制纤维蛋白凝块的生成，充分发挥其抗血栓形成作用[7]。利伐沙班有可预知的药效学和药动学。起效迅速，口服后约 2-4h 即达到峰浓度，有较高的生物利用度；与食物、药物相互作用少；无需常规监测并调整剂量；有较宽的治疗窗[6,8]。利伐沙班较现有的传统抗凝药物具有显著优势。同时，相对于间接FXa 抑制剂而言，如黄达肝葵钠（依赖抗凝血酶的间接 FXa 抑制剂），利伐沙班能更有效抑制血栓的生成[7,9,10]，且不需要静脉给药。虽然利伐沙班无需常规实验室监测，但其具有抗栓作用的同时，也伴随着抗止血作用。故在一些特殊临床状况下，仍需对其进行监测。例如肾功能不全，剂量意外或故意过量，择期手术前，了解确切的治疗中断时间，缺血性卒中溶栓前以及急性不明原因的严重出血等[11,12]。所以很有必要找到一个可靠的抗凝药动学指标来预测利伐沙班的抗栓作用，并对其所伴随的抗止血作用进行监测，以确保利伐沙班有效抗栓的同时，不增加出血风险。用于测量利伐沙班药物浓度最精确的方法是液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[13,14]，有研究表明，房颤人群中每天给予 20mg 利伐沙班口服，2-4 小时达到 290ng/ml的药物浓度高峰，24 小时达到 32ng/ml 的药物浓度低谷[15]。但是目前尚不明确利伐沙班确切的出血浓度节点，且在大多数医学实验室中，药物浓度检测不容易实现[13]，临床应用则更少。对利伐沙班进行量化和监测的实验室指标目前尚存在争议，有研究表明抗 FXa 活性、PT、dPT 等可反映体内利伐沙班浓度[16-18]；抗 FXa 活性与血药浓度呈线性相关（r2=0.95~1.00）[14,19-22]，抗 FXa 活性可以对利伐沙班进行量化和监测；然而也有文献报道，PT 对利伐沙班并不灵敏，同时 APTT 也缺乏灵敏度及血药浓度相关性[23,24]。故本研究目的之一为探寻可对利伐沙班进行量化和监测的可靠实验室药动学指标。大量临床研究对利伐沙班的疗效进行了评估，例如 ATLAS ACS2-TIMI 51 试验表明利伐沙班能有效降低 ACS 患者心血管死亡、心肌梗死和卒中的发生率[25,26]；RECORD 临床试验也证实了利伐沙班能有效预防全髋关节置换术或全膝关节置换术后静脉血栓栓塞[27-30]。ROCET AF 研究表明利伐沙班对房颤患者卒中和全身性栓塞预防的疗效不劣于华法林，而两者严重出血没有显著差异，且利伐沙班更少发生颅内出血和致死性出血[31]。这些研究进一步支持了利伐沙班的抗血栓形成作用。基于以上部分研究成果，利伐沙班已被欧洲药品局和美国食品和药品管理局批准用于深静脉血栓栓塞（VTE）治疗和预防，非瓣膜性房颤脑卒中的预防，以及骨科大手术后静脉血栓栓塞的预防。在我国利伐沙班目前多用于骨科手术后静脉血栓栓塞的预防，而在房颤抗凝治疗方面，由于价格昂贵、医疗保险不完善等原因，临床用药经验缺乏。目前利伐沙班临床应用尚处于起步阶段，使得临床相关数据不足。本研究旨在评估利伐沙班对兔颈静脉血栓模型血栓形成的影响，评价其抗栓作用；同时鉴于利伐沙班量化和监测的实验室指标尚存在争议，故本研究进一步检测了包括活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间（TT）、抗 FXa 活性和凝血因子（FII、FX）活性在内的相关实验室指标，从而探寻可用来预测利伐沙班抗栓作用并对其进行监测的可靠指标，以期对临床用药有所借鉴。
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材料和方法
1.材料1.1.实验动物：选用苏大南校区心内科实验室健康家兔进行实验，体重 1.9~2.4g，实验前晚禁食，但可自由饮水。该试验符合实验动物管理委员会要求，遵循动物实验基本伦理准则。1.2.药品、试剂、主要器材：1、利伐沙班(Rivaroxaban，商品名：拜瑞妥)：10mg 每片，由德国拜耳公司提供；2、蒸馏水：溶解利伐沙班，配制成 0.5mg/ml 溶液，并加热至 37℃，放置在超声浴中 60 分钟；3、凝血酶：1000u 凝血酶溶于 4ml 生理盐水，现配现用，美国 sigma 公司提供；4、2%戊巴比妥钠由苏大南校区心内科实验室提供；5、1.8ml 3.8％枸橼酸钠(1：9)抗凝管；6、EPPENDORF管(600u1)：AXGEN公司；7、200ul移液管：AXGEN公司；8、200ul移液器：AXGEN公司；9、STA凝血分析仪(STA -Compact. CT)：法国STAGO公司；10、与凝血分析仪配套的凝血酶原时间（Prothrombin time, PT）、活化部分凝血活酶时间（Activated partial thromboplastin time, APTT）、凝血酶时间（Thrombin time,TT）、抗 FXa 活性、凝血因子活性(包括 FII、FX)以及相应的乏因子血浆、校准品、质控品、清洗液、稀释液等试剂盒均由法国 STAGO 公司提供，且所有的试剂均为同一批次产品。
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2.方法2.1 抗 FXa 活性和 PT 时间分布分组：选取 24 只健康家兔，随机分为四组（n=6）：利伐沙班 0.3mg/g 剂量组,1.0mg/g 剂量组,3.0mg/g 剂量组,10.0mg/g 剂量组。实验：股静脉置管并留取血样，每只家兔于服药前以及服药后 2,8,24 小时分别采血送检[24]，评估抗 FXa 活性和 PT 的时间分布。2.2 建立颈静脉血栓模型2.2.1 分组选用健康家兔 30 只进行实验，体重 1.9~2.4g，随机分为五组：1.对照组（6 只），予安慰剂（蒸馏水）灌胃；2.R0.3 组（6 只），予 0.3mg/g 利伐沙班溶于蒸馏水后灌胃给药；3.R1.0 组（6 只），予 1.0mg/g 利伐沙班溶于蒸馏水后灌胃给药；4.R3.0 组（6 只），予 3.0mg/g 利伐沙班溶于蒸馏水后灌胃给药；5.R10.0 组（6 只），予 10.0mg/g 利伐沙班溶于蒸馏水后灌胃给药。2.2.2 实验准备家兔在实验前晚禁食，但可自由饮水。术前耗材准备包括：无菌纱布，台布，洞巾，手套，医用口罩、帽子，扩口器、灌胃管、烧杯，不同规格一次性注射器，医用缝合针、缝合线，止血凝胶海绵，生理盐水，安尔碘消毒液，培养皿，滤纸。手术器械包括：弯头剪，直剪，直镊，有齿镊，手术刀片、刀柄，带有塑料套管的直止血钳，直止血钳，弯止血钳，持针器。
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前 言.................................1材料和方法..........................4结 果................................9讨 论..............................15结 论..............................18参考文献..........................19
讨 论
利伐沙班是高效口服直接 FXa 抑制剂，对 FXa 有高度选择性：能有效抑制结合至血小板磷脂表面的 FXa，同时对凝血酶原酶复合物中的 FXa 也有高度亲和力。本实验旨在探讨利伐沙班对兔颈静脉血栓模型血栓形成的影响；并通过检测包括抗 FXa活性、PT、APTT、TT 和凝血因子（FII、FX）活性在内的相关实验室指标，进一步探寻可用来预测利伐沙班抗栓作用并对其进行监测的可靠指标。研究表明，利伐沙班能有效抑制血栓形成，同时抗 FXa 活性是预测利伐沙班抗栓作用并对其进行监测的一项有效实验室指标。利伐沙班对 FXa 活性的抑制因不同物种而有所区别，既往研究表明，利伐沙班对人和兔 FXa 有相似的亲和力，FXa 活性抑制相似（人 IC50 0.7nM，兔 0.8nM）[7]。同时，其他 FXa 抑制剂也显示出人和兔有相似的 FXa 抑制，但是对大鼠 FXa 抑制作用较少[35-37]。另外，直接 FXa 抑制剂对 PT 的影响也因物种而有所不同。Perzborn[7]研究了利伐沙班对人、兔、和大鼠血浆 PT 的影响，结果显示 PT 在大鼠中延长最少。有研究探讨了 Darexaban 对人、猴、狗、兔、大鼠和小鼠血浆 PT 的影响，结果表明人和兔在类似的血浆药物浓度下，可双倍延长 PT[38]。故本实验最终选择家兔模型来探究利伐沙班的抗栓作用。曾有文献报道诱导静脉血栓形成的模型[32-34]：通过夹闭一段颈静脉，造成血液瘀滞，并向颈静脉段内注射凝血酶，而诱导血栓形成。也有文献报道诱导动脉血栓形成的模型，如大鼠和兔动静脉分流模型[7,39-41]，此模型诱导形成的血栓是混合型血栓，主要包括血小板和纤维蛋白，模拟临床动脉血栓生成。此外，也有不少动脉血栓模型是通过电化学方式[42,43]，球囊扩张致斑块破裂继发血栓等方式诱导[24]。而本实验主要目的为模拟临床静脉血栓形成，故采用夹闭法诱导富含纤维蛋白、贫血小板的红色静脉血栓生成。鉴于既往研究利伐沙班对 PT、APTT、FXa 活性抑制等作用时，曾采用 0.3mg/g，1.0mg/g，3.0mg/g，10.0mg/g 四个剂量组进行研究[7,24,32]，故本实验继用上述四个利伐沙班剂量组进行实验。
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结 论
1、口服利伐沙班能有效抑制兔颈静脉血栓模型血栓形成；2、口服利伐沙班后 PT 在 3.0mg/g 组，10.0mg/g 组延长，在 0.3mg/g 组，1.0mg/g组不延长且两组之间无差异；服药后不延长 APTT、TT；3、服用利伐沙班后 FII 活性和 FX 活性降低；4、口服利伐沙班后抗 FXa 活性呈现剂量依赖性增加，且颈静脉血栓重量和抗 FXa活性之间高度相关，抗 FXa 活性是预测利伐沙班抗栓作用并对其进行监测的一项有效指标。
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参考文献（略）