香烟PM2.5抑制RBM5诱导支气管上皮细胞恶性转化机制的研究

引 言

近些年来，雾霾天气对人类健康的威胁已日渐成为关注的焦点。空气环境污染中的 PM2.5 可引起呼吸道疾病甚至肺癌，而燃烧的香烟烟雾作为室内 PM2.5污染的罪魁祸首及主要来源，其致癌性更应受到重视。吸烟不仅是最严重的危害公众健康的问题之一，也是诱发肺癌、慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病与哮喘的重要病因[1]。根据世界卫生组织的调查报告显示，直到 2030 年全球每年因吸烟所致的死亡人数将达到 1000 万[2]，而在这些死亡的人数中大约有 25%是死于肺癌。吸烟已被确立为引发肺癌最危险的因素，吸烟者的肺癌发生率将比非吸烟人群高 15-30 倍[3]。香烟 PM2.5 作为空气环境中 PM2.5 的重要组成部分，诱发肺癌的风险越来越受到全世界的关注，其中的发病机制研究更是国际上研究的热点。然而，对于香烟 PM2.5 诱发支气管上皮细胞恶性转化的精细机制却知之甚少，本课题将在此方面进行初步的探索。我们知道，抑癌基因功能缺失;是肺癌发病机制中的关键因素。RNA 结合基序蛋白 5 基因（RBM5），也是被命名为LUCA-15;或H37;，是位于人类染色体 3p21.3 区域，该区域包含有一个或多个肿瘤抑制基因，并且在大多数人类肿瘤中是缺失的[4]。相关研究表明，在多种类型的癌症中 RBM5 的表述是下调的，如 Ras 转化鼠胚胎成纤维细胞[5]、前列腺癌[6]、人前庭神经鞘瘤[7]和原发性肺癌[8]。也有报道显示，在乳腺癌组织中，与非肿瘤组织相比，RBM5 mRNA的表述水平略有上调，而其蛋白的表述水平是明显升高的。这些数据显示在乳腺癌组织中 RBM5 的表述不同于其他类型癌组织，提示在不同的肿瘤发生发展中RBM5 参与了复杂的调控网络机制，表现出了选择性剪接、致癌基因的表述及组织特异性功能[9-11]。通过多种靶基因前体 mRNA 的剪接，RBM5 能够在一些恶性肿瘤中调控细胞的凋亡及细胞周期阻滞，尤其是在非小细胞肺癌[4,5,8,12-18]。此外，在原发性肺癌中 RBM5 表述下调也与淋巴结的转移相关[13]。有研究显示，RBM5的表述也与吸烟状况呈负相关性[12]。Wnt 信号通路在多种影响组织发育的因素中起关键性调节作用，如细胞增殖、极性和迁移等[19]。Wnt 信号分子至少通过三种信号途径触发基因的转录：經典途径或β-catenin 途径，和两个非經典途径。当 Wnt 蛋白与它们的跨膜受体Frizzleds（Fzd）和辅助受体 LRP5/6 结合后，經典途径发挥作用，未降解的β-catenin 分子转移入核激活 TCF-LEF 依赖的基因转录。在 Wnt 信号缺失时，细胞质的 β-catenin 在 APC-Axin-GS3β 复合物[19]作用下发生磷酸化，随后被降解。在非經典途径中，N/AP1 依赖的、PCP 和 PC/CAMII/NFAT 依赖的 Ca2+通路被激活。相关报道及我们的前期工作显示，Wnt/β-catenin 通路与吸烟引发的肺部疾病密切相关。香烟或尼古丁能够通过刺激 Wnt/β-catenin 的激活诱导上皮-间质转化[20]。而 A549 细胞暴露于香烟烟雾后，发现 Wnt 通路被激活，β-catenin表述上调，而 RBM5 又参与 Wnt/β-catenin 通路的调控。说明在香烟干预的过程中，RBM5 与 Wnt 通路与参其中，并起到关键性调节作用。在吸烟的过程中支气管上皮细胞是能够直接受到香烟 PM2.5 的影响而发生病变的部位。然而，对于香烟 PM2.5 作用于支气管上皮细胞后，RBM5 的表述情况，特别是在香烟 PM2.5 诱导支气管上皮细胞发生恶性转化的过程中，是否RBM5 参与其中并起到重要作用，目前尚未见报道。因此，我们将对这一方面进行初步探讨。通过建立一个合适的体外模型，模拟香烟 PM2.5 慢性暴露支气管上皮细胞的过程，观察细胞是否能够发生肿瘤样转化，明确 RBM5 在其恶性转化过程中的表述水平，对转化细胞增殖、凋亡、侵袭、移植瘤生长的影响，及对Wnt/β-catenin 通路的调控作用，为进一步明确吸烟相关肺部恶性肿瘤的分子发病机制提供科学依据，为空气环境污染诱发肺癌的防治提供新思路。

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第 1 章 文献综述

1.1 环境 PM2.5 与呼吸系统的关系近年来，随着城市现代化的发展，空气污染日益恶化，其对人类健康的影响已经成为全世界关注的热点研究问题。空气污染物包括气态污染物和颗粒污染物（PM, particulate matter）。PM 的致病性是由它们的大小、成分、来源、溶解度和产生活性氧的能力决定的。研究表明[21]，雾霾一般是由高浓度的细颗粒引起的（颗粒直径小于或等于 2.5 微米，简称 PM2.5，可吸入肺颗粒）气溶胶。PM2.5具有体积小但表面积大的特点，能够携带多种有毒物质，通过鼻腔毛发的过滤，随着气流到达呼吸道的末端并聚集在那里，通过肺内气体交换损伤身体的其他部位。在日常生活中的香烟烟雾成为室内 PM2.5 污染的主要来源，调查研究显示在没有吸烟的房间里，PM2.5 的浓度小于 35 μg/m3，而在吸烟的房间里，最高值甚至达到 1000 μg/m3。当吐一口香烟烟雾时，PM2.5 的浓度可瞬间升至 320 左右，数值从 35 至 320 不到十秒钟，将自然燃烧的香烟置于 0.5 米外，数值维持在 200左右。检测车流量较多的路口 PM2.5 浓度为 260 μg/m3，而在一个相对封闭的空间内，如果两个人同时吸烟，PM2.5 的浓度很容易就超过这个数值，抽烟时间越长，数值上升越高，其数值与雾霾天气时相当。另外，香烟烟雾本身携带多种有毒物，尤其是致癌物质。因此，香烟烟雾已经成为室内 PM2.5 污染的罪魁祸首。1.1.1 PM2.5 对呼吸系统影响的流行病学证据对近 20 年的流行病学调查，研究者们发现细颗粒物与呼吸系统的发病率及死亡率有着紧密的联系[21]。空气中 PM 浓度的增加可以直接导致呼吸系统发病率及死亡率的增加[22,23]。在欧洲国家，PM2.5 的污染可使居民的平均寿命减少 8.6个月[24]。在对 29 个欧洲国家调查中发现，每平方米增加 10 μg PM10，呼吸系统的死亡率将增加 0.58%。当每平方米 PM2.5 的含量增加 10 μg ，呼吸道疾病的发病率将增加 2.07%，住院率增加 8%[24,25]。引起呼吸道疾病的症状，主要是肺功能的降低及肺心病的增加[26-28]。在对加拿大及美国的调查中发现，长期暴露于PM2.5 不仅能够引起心肺疾病，也能够使肺癌的死亡率增加[29,30]。美国在2000-2007 年之间的调查中得出 PM2.5 每平方米降低 10 μg，平均寿命将会延长0.35 年[31]，增加 10 μg 肺癌的发病率将增加 8%[32]。

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1.2 吸烟与肺癌相关性的研究进展肺癌是生存率最低的癌症类型之一，也全球因癌症而死亡的主要原因，尤其是在吸烟流行的地区。相关统计表明，由于吸烟引起的肺癌死亡率在男性中占87%，而在女性中占有 70%[50]。研究表明，吸烟不仅能够促进肺癌的发生，同时也能够促进肺癌的发展[50]。例如，在肺癌的治疗过程中，持续的吸烟与生存率的降低是关于的[51]，而在治疗期间戒烟，则会提高治疗效果[52]。另外，吸烟也能够增加吸烟与非吸烟相关癌症的复发率，如前列腺癌[53,54]。最早的对于香烟和肺癌关系的研究是在 100 年前[55]，第一次定量的进行分析是在 1929 年[55]。通过这些初步的流行病学研究、动物肿瘤相关实验、细胞病理学实验及香烟烟雾中致癌的化学物质分析[56]，越来越多的证据表明吸烟是导致肺癌的重要危险因素[57]。1.2.1 香烟主要致癌成分香烟烟雾中大约含有 5000 余种化学物质，有 73 种已被确定为对人类及动物有致癌作用[58,59]，如多环芳烃，亚硝胺，芳香胺。尼古丁是香烟的主要成分之一，能够促进癌症的发展，其通常被认为是肿瘤的启动子[50]。在这些致癌物中，一种尼古丁衍生的亚硝胺，亚硝胺 4 -(甲基)-1 -(3-吡啶基)- 1-丁酮(NN)，最近被证明与肺癌有显著的关联[60]。在动物实验中是最强的致癌物，并且认为是香烟致癌中最重要的原因[61-67]。NN 导致肺癌发生的发病机制被广泛的研究，大部分研究都集中在酶的活化和对 NN 的解毒，以及 NN 代谢物诱导脱氧核糖核酸加合物和基因突变形成的能力。

大多数香烟烟雾中的致癌成分是药物代谢酶，如细胞色素 P450、谷胱甘肽-S-转移酶和 UDP-葡萄糖醛酸转移酶，他们能够催化转变为水溶性形式，最终解毒排泄。但是在这一过程中，活性中间体如碳正离子和化合物能够被产生出来，并且这些亲电化合物能够与 DNA 的亲核位点如脱氧鸟苷的氮或氧原子及其他DNA 碱基相互反应。DNA 加合物的形成在致癌过程中起着关键性的作用。我们知道，DNA 加合物在生物进化的过程中是十分重要的，它能够调控 DNA 修复酶修复受损的 DNA。有些具有罕见综合征的病人是因为 DNA 修复缺失造成的，如着色性干皮病，极容易发展成为癌症。如果 DNA 加合物持续修复，在 DNA 复制过程中将会导致编码错误，而旁路聚合酶催化插入错误的碱基产生相反地加合物，这将导致永久性突变。如果突变发生在癌基因关键的区域，如 ras 或肿瘤抑制基因 TP53，结果无疑会引起正常细胞增殖控制机制障碍，引起肿瘤的发生。应用基因测序的方法证明了在吸烟者的肺中已存在上千种突变的基因，其中包括具关于键作用的肿瘤调节基因，最常见的是 ras 和 TP53[68-71]。

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第 3 章 结果........................................................493.1 香烟提取物（CSE）诱导支气管上皮细胞 BEAS-2B 恶性转化情况及 RBM5 的表述水平....493.1.1 CSE 暴露下，BEAS-2B 转化细胞生存率增加.................493.1.2 CSE 暴露，BEAS-2B 转化细胞形态学发生改变............. 50第 4 章 讨 论..................................................79第 5 章 结 论..................................................85

第 4 章 讨 论

近年来，雾霾天气对人类健康的威胁已日渐成为关注的焦点。空气环境污染中的 PM2.5 可引起呼吸道疾病甚至肺癌，而燃烧的香烟烟雾中富含 PM2.5，是室内 PM2.5 的罪魁祸首及主要来源。与空气环境中的细颗粒物相比，香烟 PM2.5能够长时间悬浮于室内环境中，极容易吸入肺内，永久性沉积在肺泡，且香烟烟雾中含有 5000 余种化学物质，其中有 70 余种已被证明具有致癌性，能够增加诱发肺癌的风险。相关调查显示，肺癌是目前生存率最低的癌症类型之一，也是全球因癌症而死亡的主要原因，其发病与吸烟有着密不可分的联系。吸烟者发展为肺癌的风险为非吸烟者的 15-30 倍，而 90%的肺癌患者是由吸烟所导致的。香烟 PM2.5 作为空气环境中 PM2.5 的重要组成部分，诱发肺癌的风险越来越受到全世界的关注，其中的发病机制更是国际上研究的热点。然而，目前对其致癌过程中的精细机制却知之甚少。因此本研究选取室内 PM2.5 主要来源之一的香烟烟雾作为肺癌的诱发因素，通过体内外实验初步探索其诱导的人支气管上皮细胞发生恶性转化过程中的作用机制。在本实验研究中，我们成功构建了香烟烟雾提取物（CSE）即香烟 PM2.5，持续暴露于人正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）的体外模型，以模拟慢性吸烟现实。我们观察 BEAS-2B 细胞持续暴露于 CSE 8 天后，恢复正常培养 2 周期间，细胞发生明显的表型改变，具有致癌转化的特性，包括增殖增加、倍增时间缩短、侵袭及迁移能力的增强，更重要的是具有体内移植瘤形成的能力。同样地，在细胞水平上，我们检测到在 CSE 诱导的 BEAS-2B 细胞内 C-myc、-ras、Cyclin A和 Cyclin D1，这些致癌基因表述上调。相关研究以及这些结果表明，慢性暴露于 CSE 能够诱导 BEAS-2B 发生恶性转化[262]。同时，在这些恶性转化的细胞中，我们检测 RBM5 的表述水平，与人肺腺癌 A549 细胞作对照，结果发现 RBM5的 mRNA 和蛋白水平均发生下调。这提示 RBM5 的表述与吸烟相关性肺癌存在负相关性。这一结果与前期的研究，即在有吸烟史的肺癌患者的肿瘤组织中RBM5 的表述下降，是互相印证的。

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第 5 章 结 论

1、香烟提取物（CSE）能够诱导正常支气管上皮细胞发生恶性转化，细胞表现为增殖增加、倍增时间缩短，侵袭、迁移能力增强，致癌基因表述上调，具有裸鼠成瘤能力。2、香烟提取物（CSE）诱导后，发生转化的 BEAS-2B 细胞内 RBM5 mRNA和蛋白的表述水平下调，且呈剂量依赖性。提示在 CSE 诱导支气管上皮细胞发生恶性转化的过程中，RBM5 参与其中，可为吸烟相关性肺癌的治疗提供靶点。3、过表述 RBM5 能够促进 CSE 诱导的恶性转化细胞发生凋亡、细胞周期受到阻滞、侵袭迁移能力受到抑制，且过表述 RBM5 能够抑制恶性转化细胞Wnt/β-catenin 信号通路的激活。提示上调 RBM5 能够抑制 CSE 诱导的恶性转化细胞的增殖及转移，可能成为是潜在的治疗靶点。

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参考文献（略）