脓毒症的细胞生物治疗新机制——间充质干细胞抑制巨噬细胞炎症复合

前 言

脓毒症是全球公共卫生的挑战。脓毒症发病率激增，每年新增大约 8%至 13%，死于脓毒症的全球每年约有 800 万人。每2 到 3 名院内死亡患者中，就有 1 名是脓毒症患者[2]。全球脓毒症联盟将 2021 年9 月 13 日定为首个世界脓毒症日（WSD），其目的是实现世界脓毒症宣言，即至 2021年使其发病率在全球范围下降 20%。因此，寻找更加有效的新疗法成为当前医学研究亟待解决的重要科学问题。脓毒症的病理生理是一个复杂的过程，涉及到引起刺激的微生物，宿主的免疫反应，炎症反应和凝血途径之间的相互作用，最终导致各个脏器衰竭而死亡[8]。脓毒症传统的急救方法包括处理原发疾病、抗感染与抗炎、血液净化、机械通气、复苏与支持治疗。但以往的抗感染和支持治疗并不能显著降低脓毒血症的死亡率，因此，现代治疗的方向更多转向生物治疗拮抗内毒素，抑制过度激活的炎症细胞，阻断瀑布式;释放的炎症介质[9]。间充质干细胞是一种分布于成体组织内的具有自我更新和分化潜能的前体细胞。近年发表的系列研究表明，间充质干细胞具有多种生物学效应，包括调节多种免疫细胞活性，下调炎症级联反应，减少细胞凋亡，促进血管生成，激活原位干细胞等，它已作为脓毒症生物治疗的潜在策略，但其深入的分子机制并不清楚。大量的研究发现脓毒症的发生是由复杂庞大的细胞因子网络介导的，其中巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的根本环节。脓毒症时，巨噬细胞合成和分泌的 IL-1β 等细胞因子及其他炎症介质过度释放，引起炎症级联放大反应，损伤组织和细胞，引发重症脓毒症、脓毒性休克以及 MOSD。IL-1β 的成熟稳重和活化受caspase-1 调控，而后者的调控与炎症复合体 3 的激活密切相关。炎症复合体(inflammasome)是宿主天然免疫细胞快速识别胞内感染的病原微生物及其产物的一类多蛋白复合体[16, 17]。炎症复合体 3 是目前研究最广泛的炎症复合体，针对脓毒症的发生发展及治疗中炎症复合体 3 的激活机制成为当前研究的热点。课题针对当前脓毒症生物治疗机制不明的问题，通过观察 BMSCs 移植对脓毒症小鼠生存率，器官功能、损伤程度及炎症浸润情况的影响，并通过探讨 BMSCs 与巨噬细胞相互作用与激活炎症复合体 3 之间的关系，阐明 BMSCs 移植对脓毒症小鼠治疗作用的机制，明确脓毒症生物治疗的潜在分子靶点。

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文献回顾

一、免疫治疗作为脓毒症的附属治疗：从免疫抑制到免疫刺激脓毒症是住院病人的主要死因，是许可进入 ICU 的常见原因[3]。尽管药物治疗有诸多好处，但死亡率仍高居不下。加之，从 1975 至 2000 年，在美国脓毒症的发生率每年递增 9%，每 1 万人就有 24 人罹患。造成脓毒症的死亡率每年上升 30-50%的原因除了耐药菌群，年龄和免疫抑制等[4]，发生率增加的原因可能有年龄、免疫抑制治疗、发病过程等，还因为高死亡率，在许多脓毒症患者中高达 30-40%，有待寻求新的治疗方法。經典的免疫治疗方法在最后十年反复评估是基于抑制炎症介质例如细胞因子。细胞因子被阻断在脓毒症的动物模型中发挥了有利作用，因而这种方法被深入研究[5]。但是，在众多临床实验中，传统的抑制免疫系统的方法作为脓毒症的辅助治疗并不成功。其中一个重要原因是绝大多数脓毒症病人并非死于免疫系统激烈的炎症反应，而是过分抑制免疫反应引起的二次感染[6]。1 脓毒症的病理生理过程如图 1 所示[8]，微生物侵入首先需要越过宿主的物理屏障，非特异或先天的免疫系统负责初始识别和抵御病原微生物。在过去的十年已经研究得很清楚，内在的免疫激活是通过识别微生物元件的重复结构来实现的，称为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）。这些 PAMPs 可能是微生物表面的分子，（例如 LPS、脂蛋白、鞭毛蛋白、菌毛、肽聚糖、肽聚糖相关脂蛋白和脂磷酸壁），但也有胞内模式通过细菌的溶壁作用（比如热休克蛋白和 DNA、RNA 碎片）[9]。PAMPs 被特定的模式识别受体（Pattern recognitionreceptor，PRRs）识别，此外，还包括巨噬细胞，单核细胞和树突状细胞。

(1)促炎反应但是，一般来说，脓毒症住院病人循环中的促炎因子水平很低[13]，免疫抑制的体征常被很早观察到。例如，住院病人有淋巴细胞凋亡的现象[14]，类似的早期效应与单核细胞的失活关于[15]。在这方面有意思的是针对抑制促炎因子释放的治疗并不能显著减少终点事件，例如死亡率和住院时间。一些干预措施甚至会增加死亡率，这归因于增加了激发感染的易感性[16]。足够水平的的促炎因子例如 TNF-α 对抗炎症的必要性被强调，这一发现在脓毒症和其他感染性并发症中得到发展[17]。(2)抗炎和关于联的免疫麻痹如前所述，感染同时发生促炎反应，抗炎反应是为了减小炎症及其带来的组织损伤。但是，长期持续的抗炎反应会对宿主的免疫功能造成广泛而长期的损害，就是我们所说的免疫麻痹;[10]。这种免疫抑制现实，可以从最初感染持续到数天甚至数周，导致了二次（机会性）感染的增加[18]。越来越多的证据表明，脓毒症后期的免疫抑制，很多研究表明，导致了晚期死亡的原因并非免疫抑制过程本身，而是缺少足够的免疫应答的恢复[14, 19]。迄今为止，并无证据表明脓毒症早期的抗炎免疫应答与早期机体受损的结果有必然联系。近来发现，与死于非脓毒症的病人相比，从脓毒症的病人脾和肺分离出的免疫细胞，显示出严重的免疫抑制[6]。在另外一项死于脓毒症或脓毒症休克的病人尸检研究中发现，71 例中有 63 例(88.7%)经过 7 天以上的治疗仍有连续的脓毒病灶，说明瘫痪;的免疫系统不能消除入侵的微生物[20]。而这种存在临床关联性的免疫麻痹同样频繁见于相对低毒细菌、病毒和真菌的感染和激活，包括不动杆菌属、肠球菌属真菌、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、念珠菌属等[18, 21-23]。此外，已有报道表明在单核细胞上人白细胞抗原（HLA）-DR 表述降低，目前用于识别病人免疫麻痹的标记，与大多数脓毒症病人存活率降低关于[24-27]。同样地，通过离体 LPS 刺激单核细胞减少 TNFα 的产生，另一种识别免疫麻痹的手段与存活率的下降关于[28]。最后，脓毒症的抗炎治疗缺乏积极效果，更多的注意力转向脓毒症的免疫抑制阶段[10]。因此，我们可以推论：即使原发感染已经彻底根除，免疫麻痹是造成脓毒症病人急性期后不良预后的一个重要原因。

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二、间充质干细胞在脓毒症治疗中的作用脓毒症治疗的原则是给予适当的抗菌药物和早期控制感染源。血流动力学的复苏情况，包括目标导向的容量复苏和血管活性药物支持，以及保护性肺通气是标准的脓毒症患者管理流程[103]。尽管疾病修饰药物种类众多，但能够改善脓毒症病程进展及生存率的药物寥寥无几。如前所述，脓毒症的病理生理学过程是病原体与宿主免疫系统之间复杂交互作用的结果[104]。许多研究不仅涉及免疫细胞的应答失调和细胞凋亡，而且内皮和上皮功能失调也与危重症多器官功能衰竭关系密切。因为脓毒症进程中与多条生物途径相关，所以其治疗的复杂性可想而知。随着研究的深入，间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）逐渐进入人们视线。在动物模型中，MSCs 能够降低死亡率，改善衰竭器官的功能[105, 106]。MSCs 治疗脓毒症的机制可能是免疫调节，抗凋亡，增加细菌清除率，改善内皮/上皮细胞功能障碍等。但是，从体外实验和动物实验到临床研究结果，中间有很多机制仍不清楚。1 MSC 的特性MSC 是在 1966 年由 Friedenstein 等[107]首次提出，由 0.001%-0.01%的骨髓单核细胞和中胚层衍生而来，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞以及不同分化程度的外胚层（神经元细胞）和内胚层（肝细胞）[108]。从不同组织来源的 MSCs因其良好的可塑性作为一种新方法而被广泛应用于细胞治疗和组织工程。这都有赖于分离特定表型的MSCs及其培养方法诱导成相应种类细胞以替代或支持疾病器官。多种方法联合纯化 MSCs，基于物理或生物特性，例如塑料的粘附力、免疫表型或多谱系的分化潜能[109]。MSCs 的一些显著特性包括选择性迁移、移植进入、修复损伤组织称之为归巢;。假定 MSCs 归巢类似淋巴细胞归巢，由趋化、粘附和渗出进入炎症部位这几个步骤组成。体外实验研究表明 MSCs 有向细胞因子迁移的能力，包括基质细胞衍生因子（SDF-1），表皮生长因子（EGF），血小板衍生生长因子（PDGF），血管内皮生长因子（VEGF），胰岛素样生长因子（IGF），肿瘤坏死因子 α（TNFα），白介素 1β（IL-1β）[110]。此外，MSCs 在体研究显示趋化因子受体 CXCR4 和 CCR7 会随损伤相关的 SDF-1α 生成而上调[111]。通过将 MSCs 暴露于诸如 Toll 样受体（TLRs）和 TNF-α 等来诱导趋化因子受体表述以增强 MSCs 的趋化诱导[110]。

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第二部分 骨髓间充质干细胞对骨髓来源巨噬细胞调节作用的机制研究············· 541 材料 ··········································· 542 方法 ····································· 552.1 BMSCs 的原代分离、培养、鉴定 ························· 552.2 BMDMs 的原代分离、培养、鉴定························· 552.3 细胞培养分组及干预 ·························· 563 结果 ··································· 593.1 BMDMs 的生物学特征·························· 593.2 BMSCs 对 BMDMs 的调节作用与炎症复合体 3 激活关于············· 593.3 BMSCs 减少 LPS 和 ATP 干预后 BMDMs 线粒体的损伤和 ROS 产生 ········ 61结 论···································· 70

第二部分 骨髓间充质干细胞对骨髓来源巨噬细胞调节作用的机制研究

脓毒症的发生是由复杂庞大的细胞因子网络介导的，大量的研究发现巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的根本环节。脓毒症时，巨噬细胞合成和分泌的 IL-1β 等细胞因子及其他炎症介质过度释放，引起炎症级联放大反应，损伤组织和细胞，引发重症脓毒症、脓毒性休克以及 MOSD。炎症复合体(inflammasome)是胞浆内一组复杂的多蛋白复合体，是 caspase-1 活化所必需的反应平台，调控 IL-1β、IL-18、IL-33 等促炎细胞因子的加工及活化，是宿主天然免疫细胞快速识别胞内感染的病原微生物及其产物的一类多蛋白复合体[16, 17]。炎症复合体 3 是目前研究最广泛的炎症复合体，针对脓毒症的发生发展及治疗中炎症复合体 3 的激活机制成为当前研究的热点。

1 材料1.1 实验动物1.1.1 实验动物的种类B6-EGFP 近交系 C57BL/6 小鼠（不表述 eGFP，雄性，8-10 周龄，20-24 g，SPF级）用于分离培养原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），产自第四军医大学心血管内科实验室。饲养条件：小鼠饲养于标准无特定病原体鼠笼中，饲养密度 12cm×15cm/小鼠，室温保持 21℃～25℃，湿度维持 20%～30%，正常昼夜节律（12h：12h），给予自由饮水和标准啮齿类动物饲料。1.2 主要试剂和材料试剂/材料名称 公司（产地）DMEM （高糖）培养基 Hyclone 公司（美国）LPS Sigma 公司(美国)ATP Sigma 公司(美国)Mito-TEMPO Sigma 公司(美国)3-MA Sigma 公司(美国)MitoSOX Invitrogen 公司（美国）MitoTracer Green FM Invitrogen 公司（美国）

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结 论

本研究通过观察 BMSCs 对盲肠结扎穿孔致脓毒症的治疗作用及 BMSCs 对BMDMs 的调节作用，在体水平验证了骨髓间充质干细胞辅助治疗脓毒症的有效性，细胞、亚细胞及分子水平揭示了 BMSCs 与 BMDMs 相互作用的具体机制，明确了BMSCs 能够作为脓毒症潜在的生物治疗策略的关键分子靶点，为实现脓毒症细胞治疗效益的优化提供一定的理论基础。1．在探索脓毒症细胞治疗作用机制的过程中未采用模式动物验证抑制炎症复合体 3 的激活在 BMSCs 辅助治疗脓毒症小鼠有效性中的作用。2．在 BMSCs 对 BMDMs 调节作用的机制研究过程中未采用高通量基因筛选技术明确 BMSCs 与 BMDMs 相互作用的关键分子。以上研究中存在的不足也是本课题下一步延伸的方向，需要进一步探索研究才能最终实现脓毒症生物治疗效益的优化。

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参考文献（略）