持续与间歇低载荷振动对骨折愈合影响的细胞实验研究

第 1 章 绪论随着全球经济的飞速发展，交通事故伤与高处坠落伤等高能量损伤病人逐年增多，此类损伤已成为和平时期创伤发生的最常见原因。在以上损伤中，四肢损伤，特别是四肢骨折的发生率极高，约有 5%-10%患者会发生骨折延迟愈合或骨不连，严重影响了骨折的康复进程。因此，怎样加快骨折愈合，有效防治骨折延迟愈合或不愈合已经成为热门课题。骨折的愈合过程就是骨重建过程的一部分，骨折部位所存在的力学环境对整个骨重建过程起到了只至关重要的作用，其在很大程度上影响骨形成与骨吸收之间的动态平衡。骨组织以骨细胞、成骨细胞和破骨细胞为基本单位相互作用而产生的，这其中成骨细胞是产生骨组织的重要细胞，是骨折愈合修复过程中起到关键作用的细胞，在骨重建过程中处于中心调控地位。因此研究力学刺激对成骨细胞的影响，对于研究临床上如何通过运用力学刺激方法来促进骨折愈合，治疗骨折延迟愈合或不愈合是至关重要的。将低载荷振动用来治疗某些骨科疾病是近年来一种新兴的治疗手段。近十年来的研究表明，低载荷（频率 32-37Hz，加速度 0.2-0.3g）全身振动能够促进骨的生长、对抗骨质疏松、促进骨折愈合。然而绝大多数文献报导的振动对骨及骨细胞的影响均是采用持续的振动加载方式鲜有文献报导研究持续与间歇振动对骨及骨细胞是否会有差别。因此，本试验通过对体外培养的成骨细胞系 MC3T3-E1 细胞施加持续低载荷振动以及不同间歇时间的低载荷振动，观察两种不同振动加载方式对体外培养的成骨细胞的生长及分化产生的影响的差异，并确定更加合理的低载荷振动周期，为进一步研究低载荷振动促进骨重建的力学-生物学机制提供依据，以及为我们以后在临床上更好的运用振动防治骨科疾病提供更有力的理论支持。.........第 2 章 综述2.1 骨折愈合过程目前骨折愈合的机制尚不明确。骨折的正常愈合过程一般分为三个时期，这三个时期是相互重叠逐步演进的，并没有一个明确的界限。（1）血肿炎症机化期：骨折后，局部形成血肿。伤后 6～8 小时，凝血块逐渐形成，发生无菌性炎症反应，肉芽组织逐渐出现，最终转化成纤维组织。这一过程大约在骨折后 2 周完成。（2） 骨痂形成期：此过程包含了膜内成骨和软骨内成骨两种产生骨的过程，此过程一般需 4～8 周。X 线片上已经能够看到骨折部位有骨痂形成，然则骨折线仍然能够见到。膜内成骨主要形成骨性骨痂，其中骨外膜是主要参与的组织，损伤骨外膜可造成骨折愈合不良。（3）骨痂塑形期：生物力学应力作用于骨痂内的骨小梁，使得骨小梁在应力作用下按照应力方向从新排布，达到再塑形的目的。力学性能更佳的成熟稳重骨组织渐次替代原始骨痂，此阶段既是新骨的爬行替代过程。破骨细胞和成骨细胞相互作用完成了新骨的爬行替代，约需 8～12 周。骨的力学强度完全恢复正常，需要数月到数年的时间，这期间根据 Wolff 定律骨结构因功能的需要不断进行重建。近年来，众多的研究已经证骨折愈合和重建过程受到多种生物因子的影响。此外，良好的血供和两骨折端合理范围内的相对微弱活动及力刺激是骨折愈合的必要条件。.........2.2 影响骨折愈合的因素骨折愈合的机制十分复杂，并且骨折愈合过程会受到多种因素的调控，影响因素大致可分类为自身因素、力学因素、化学因素、生物因素四大类。2.2.1 自身因素年龄、自身营养状况、激素水平、骨折部位等自身因素都会密切左右骨折的愈合。儿童时期生长发育旺盛，代谢活跃，组织损伤后能够很快修复，但老年人却恰恰相反。儿童骨折愈合时间一般情况下会较成人缩短，老年人则会有可能发生骨折延迟愈合或者不愈合。骨折愈合需要有充足的物质基础，营养现实好的患者，能够充分供给骨折愈合所需要的各种营养物质，其骨折愈合的程度就会明显好于营养不良人，如患者长时间经受慢性消耗性疾病，导致消耗性营养不良，其发生骨折延迟愈合或者不愈合的概率将会明显增加。绝经后的女性，因其卵巢功能退化进而导致血雌激素含量降低，致使甲状旁腺功能亢进，作用于骨细胞和破骨细胞，引起骨质过度分解，进而造成骨折愈合延缓。不同地方的骨折其愈合程度及时间也是不同的，骨折部位的血液微循环是保证骨折愈合不可缺少的条件，骨折部位血液微循环良好，则骨折能够快速愈合，例如发生在骨松质部位的骨折；股骨头骨折中的头下型骨折，有很大几率灰毁伤股骨头滋养血管，极易造成远期骨不连及股骨头坏死。此外骨折的愈合还会受到心里状况的影响。........2.3 骨折延迟愈合或不愈合的治疗随着全球经济的飞速发展，交通事故伤与高处坠落伤等高能量损伤病人逐年增多，此类损伤已成为和平时期创伤发生的最常见原因。在以上损伤中，四肢损伤，特别是四肢骨折的发生率极高，约有 5%-10%患者会发生骨折延迟愈合或骨不连，严重影响了骨折的康复进程[8]。因此，怎样已经成为重要课题。目前对于加快骨折愈合，有效防治骨折延迟愈合或不愈合的相关研究主要有以下几种。手术治疗骨折延迟愈合或不愈合是目前相关科室使用最多、效果最好的方法，经过多年的发展，现如今手术治疗骨折延迟愈合或不愈合的方法主要有植骨术、内固定术及外固定术。a）植骨术：在骨折部位或者骨缺损部位植入任何骨组织或骨材料都称之为植骨术。随着临床应用的不断发展，出现了不同方式的植骨术，包括带蒂骨移植、骨膜移植、人造骨移植及自体骨髓移植。带蒂骨移植是将带有丰富血运的骨整体移植到骨不连部位，有效解决了某些血供较差部位的骨不连和骨缺损问题。最近几年来，借助显微外科技术成功地解决了骨膜缺血的问题，显著提高移植骨膜的存活率，自体游离骨膜生发层细胞有很高的增殖分化能力，植入骨折或骨缺损处后能够很快分化形成成骨细胞，有着较强的成骨能力，因此骨膜移植在治疗骨不连方面取得了不错的疗效[9]。人造骨移植所使用的人工骨其自身并没有诱导新骨形成的作用，人工骨主要起的作用是在新骨形成过程中起到爬行替代作用。人工骨的优点在于植入人体后不会产生像同种或异种骨的排异反应。骨髓间充质干细胞大量存在于骨髓之中，研究认为自体骨髓移植技术简易易操作，安全性高，经济、实用且有效。.........第 3 章 材料与方法........123.1 细胞.......123.2 主要试剂...........123.3 主要仪器...........133.4 相关试剂配制.......133.5 实验方法...........143.6 统计方法...........24第 4 章 结果......254.1 不同振动加载方式对成骨细胞增殖的影响.......254.2 不同振动加载方式对成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）基因表述及胞内活性的影响...........254.3 不同振动加载方式对成骨细胞分化相关因子 OCN 与 COL Ⅰ的表述的影响.......264.4 不同振动加载方式对成骨细胞 OPG 基因与 RANL 基因表述的比的影响.........284.5 不同振动加载方式对成骨细胞分泌 RANL 及 M-CSF 的影响........28第 5 章 讨论......30第 5 章 讨论机械应力是影响骨的生物力学机能与结构的关键因子之一。成骨相关细胞能够响应多种机械刺激，例如拉伸应力、流体剪切力、四点弯曲应力及静水压力。近年来，越来越多的证据表明，低载荷机械振动能够促进体内骨形成。然而，低载荷机械振动对成骨细胞作用机制的探索还不是很全面。在这项研究中，我们通过对体外培养的 MC3T3-E1 成骨细胞施加低载荷机械振动，研究了持续低载荷振动（sLMHFV）和间歇低载荷振动（iLMHFV）对成骨细胞增殖，成骨蛋白的表述，与成骨细胞分泌相关破骨因子的影响。我们的 MTT 法测定结果显示，sLMHFV 或 iLMHFV连续加载 7d，未引起成骨细胞增殖显著变化。以往对于低载荷振动对成骨相关细胞增殖的影响是存在差异的。已有报道表明，人牙周膜干细胞和 MSC 的生长可被低载荷振动抑制[23]。然而，也有报道表明，低载荷振动增强了 MSC 的生长[24]。在这项研究中，我们发现在我们设定的实验条件下，sLMHFV 或 iLMHFV 不能影响 MC3T3-E1 细胞增殖。有趣的是，有人研究发现，压力负荷对成骨细胞增殖的影响是由加载频率和持续时间依赖性的[25]。综合前人研究成果和数据来考虑，我们可以认为，低载荷机械振动对成骨细胞增殖的影响在很大程度上取决于细胞的类型和振动参数。

............结论1、低载荷振动（35Hz，0.25g）可以促进成骨细胞的分化，并且可抑制成骨细胞分泌破骨细胞刺激因子，进而抑制破骨细胞活性。2、间隔 0.5h 的低载荷振动（35Hz，0.25g）促进成骨细胞分化的效果优于持续振动组。3、低载荷振动（35Hz，0.25g）对成骨细胞的增殖无显著影响。..........参考文献（略）