Notch重组配体D1R在促进造血重建中的作用与机理

前 言

尽管如此，受机体复杂造血微环境影响，体内扩增 HSC 以及造血重建的相关研究进展缓慢。所幸的是，近年来对造血微环境的研究取得了长足进展，越来越多的治疗方向浮出水面。1978 年 Schofield 教授首次提出了干细胞龛（niche）的概念，越来越多的研究表明 niche 是体内容纳干细胞、调控其行为的细胞和细胞外基质微环境，它通过分泌各种造血生长因子、与 HSC 直接作用等方式，调节 HSC 在正常和应激造血环境下的存活、干性维持、增殖和分化，进而维持造血的动态平衡，参与的主要信号通路包括 Notch、Wnt、Hedgehog、BMP、HOXB4、Tie2、Bmi、PU.1、GATA 及 Myb 等。最新文献表明，除了传统意义上的骨内膜龛和血管龛，事实上造血龛内多种细胞类型均参与了 HSC 的调控，包括血管周细胞、窦状内皮细胞、巨噬细胞、CAR 细胞、交感神经和非髓鞘性施旺细胞等，其中小动脉窦状内皮细胞被认为是启动造血重建和再生的核心结构基础，在调控HSC 再生过程中发挥着关键作用。在结构上，骨髓窦状内皮细胞缺乏基底膜、薄壁，需要与周围造血细胞密切接触共同维持窦状血管的完整性。在功能上，骨髓窦状内皮细胞表述的粘附分子、配体及其基因表述谱也不同于其它器官的血管内皮细胞。在 HSC 龛中，窦状内皮细胞与HSC 关系密切。

......

文献回顾

一、骨髓损伤与造血重建1 正常造血1.1 正常造血在生理情况下，人体每天有大量造血细胞再生与衰老，造血稳态的维持依赖于HSC 的自我更新与多系分化，一系列细胞因子参与了造血的分级调控（图 1）HSC 是所有血液细胞的来源，主要定植在骨髓（bone marrow，BM）中，很少一部分（<0.1%）循环在外周血液里。1961 年 Till 和 McCulloch教授首次提出了造血干细胞的概念(1)，从此干细胞领域成为了生命科学研究的热点之一。造血干细胞是一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞，能产生多种成熟稳重细胞，其主要功能是维持造血稳态。半个多世纪的研究不仅揭示了不同谱系的造血等级分化以及细胞因子对造血的分级调控，而且发现了一系列抗原表面标志物以鉴定处于不同分化阶段的造血细胞（图 2）(2)，为研究造血及造血调控提供了良好平台。造血干细胞的生命活动受自身表述因子（如信号分子、转录因子等）和周围环境（如细胞因子、粘附分子等）的精细调控。自胚胎末期，HSC 主要定居于骨髓造血微环境（造血龛，niche）中，其结构与功能的维持密切依赖于 niche。早在 1978年，Schofield 教授就提出了造血干细胞龛的概念(21)，目前普遍认为 niche 是体内容纳干细胞、调控其行为的细胞和细胞外基质微环境，它通过分泌各种造血生长因子、与 HSC 直接作用等方式，调控 HSC 在正常和应激造血现实下的存活、干性维持、增殖和分化，进而维持造血的动态平衡(22)。骨髓窦状内皮细胞是构成 HSC 龛的主要支架细胞，有着不同于其它实质脏器血管内皮细胞的结构与功能。在结构上单层细胞的骨髓窦状内皮细胞位于血管表面，缺乏基底膜、薄壁，无紧密连接，被周细胞、动脉外膜网状细胞和 nestin+CAR 细胞覆盖，需要与周围造血细胞密切接触共同维持窦状血管的完整性。在功能上，骨髓窦状内皮细胞的基因表述谱及其所表述的配体和粘附分子也不同于其它器官血管内皮细胞，它是连接血液和骨髓组织的重要桥梁，对于造血损伤后 HSC 的维持和再生起着尤为重要的作用(17, 29)。研究显示，EC 和 HSC 共同起源于胚胎时期的多能造血干前体细胞（又名成血管细胞），但目前还没有证据表明 EC 能向血管周细胞分化(30, 31)。

......

二、Notch 信号途径对造血调控的多样性半个多世纪以来，科学家们发现许多信号通路均能维持 HSC 的自我更新，促进其扩增，它们包括 Notch、Wnt、Hedgehog、BMP、HOXB4、Tie2、Bmi、PU.1、GATA及 Myb 等。其中，高度保守的 Notch信号从胚胎发育到成年造血对维持 HSC 未分化现实、增殖、分化均起着重要调控作用，同时由于需要临近细胞 Notch 受体与配体的直接接触，在很多方面成为理想的连接 niche 与 HSC 的桥梁。1. Notch 信号通路概述1.1 Notch 信号通路的组成Notch 基因最早于 1917 年由遗传学家 Morgan 发现，该基因的缺失将导致果蝇翅膀边缘缺刻（notches），因此将其命名为 Notch(167)。从线虫到人，各物种间的經典Notch 信号途径具有高度保守性，在细胞生长、分化及命运决定等方面发挥着重要作用。Notch 信号通路包含五种 Notch 配体（agged 1、agged 2、Delta-lie 1、Delta-lie3、Delta-lie 4）和四种 Notch 受体（Notch1-4）（图 6）。配体胞外区由 DSL 基序和多个 EGF 样重复序列组成，主要发挥与受体结合的功能。受体胞外段则包含 3 个LIN 负性调控重复序列以及 33-36 个随机排列的 EGF 样重复序列；受体胞内段包含1 个 RAM 基序、1-2 个核定位信号（NLS）、多个锚蛋白（AN）重复序列、1 个 PEST基序，以调节蛋白稳定性。Notch1 和 Notch2 含 TADs，Notch3 和 Notch4 则缺失该基序(76, 77)。Notch 受体合成后，蛋白转化酶会介导其 S1 位点发生切割，以促进Notch 激活后受体向胞膜运输；通过高尔基体时，Notch 受体会被糖基转移酶（如Fringe）糖基化，以决定 Notch 受体对不同 Notch 配体的反应(78, 79)。1.2 Notch 信号通路的激活Notch 信号通路的传导由一系列复杂分子事件组成（图 7），Notch 受体与配体相互作用后会触发分别由 ADAM10 非金属蛋白酶和 γ 分泌酶（GSI）介导的连续 2次蛋白剪切反应，导致 Notch胞内段（ICN）和胞外段（NECD）的释放。NECD 与信号发出细胞配体胞外段一起被内吞，Notch 受体的 ICN 则被释放入胞浆并转移到胞核(81)。在细胞核内，ICN 通过 RAM 结构域与转录因子 RBP- 相互作用，取代辅阻遏物 SMRT 和 CtBP1 的位置，并招募辅激活物 MAML1 和乙酰转移酶 p300，从而激活 Hes 等靶基因的转录，发挥生物学功能(80, 82)。

......

第四部分 Notch 信号与临床造血干细胞移植后造血重建的相关性研究...............1281 材料 .................................................................... 1281.1 实验仪器............................................................. 1281.2 实验材料.............................................................. 1281.2.1 临床样本.......................................................... 1281.2.2 试剂.............................................................. 1281.2.3 抗体................................................................ 1281.2.4 引物 .............................................................. 1281.2.5 主要缓冲液......................................................... 1292 方法................................................................ 129

第四部分 Notch 信号与临床造血干细胞移植后造血重建的相关性研究

1 材料1.1 实验仪器仪器名称 公司名称自动恒温摊烤烘片机 西安瑞丰仪器设备公司1.2 实验材料1.2.1 临床样本经陕西省西安市第四军医大学第一附属医院和第二附属医院伦理委员会批准，选择血液内科层流移植病房 2021~2021 年间行异基因造血干细胞移植的患者入组，另设置健康对照人群，将其分为健康对照、预后好、预后不良、死亡四组，共 41 人，收集其清髓处理前、移植后 2 周、移植后 6 周外周血样各 2ml，所有样本获取均为患者知情同意。1.2.2 试剂所用试剂同前。1.2.3 抗体所用抗体同前。

......

4 讨论根据本课题前三部分的实验结论，结合 GEO 数据库中临床造血干细胞移植患者原始芯片数据的生物信息学分析结果，我们设想造血干细胞移植术后，患者体内Notch信号的激活水平与患者预后存在正相关性。经历近 2 年的临床样本收集及随访，首先，我们发现全部健康捐献人群血样和大部分骨髓移植患者移植前血样均存在Notch 下游入核活化片段 ICN1 的膜定位信号，提示生理稳态下 Notch 信号大多处于静息现实。其次，绝大多数移植成功且预后良好的患者在移植后第2周即出现了ICN1核定位信号强阳性，反之，预后较差的患者则表现出 ICN1 核定位信号弱阳性以及部分膜定位信号阳性共存现象，结合 Notch 信号下游靶基因的表述情况，从核酸和蛋白质水平论证了骨髓移植患者术后体内 Notch 信号活化程度与患者预后存在正相关性。再次，预后良好的移植患者出现了不同程度 Csf2rb 上调，但预后较差的移植者体内 Csf2rb 表述无明显改变，提示 CSF2RB 很可能是 Notch信号调控造血重建的下游靶分子。综上所述，本部分实验主要从临床样本角度映证了前期整体动物水平和细胞分子水平所发现的现象以及机制，为将 Notch 应用于患者早期预后评估提供了新的检测方法，更为术后利用 Notch 信号激活剂进行医疗干预提供了新的治疗靶点和治疗方向。

......

小 结

本实验从整体动物、细胞以及分子水平着重研究了应激条件下 Notch 信号通路在体内对造血系统损伤再修复过程的调控作用以及机理机制，主要研究结论如下。1、Notch 信号缺失不利于造血系统损伤再修复将 Notch配体 Delta lie 1 的 DSL 结构域和整合素分子 αVβ3 特异性配体 RGD相融合，表述出新型内皮细胞靶向的 Notch 信号激活剂重组配体 mD1R 蛋白。在电离辐射以及化学药物诱导野生小鼠多种骨髓损伤模型中，证实 mD1R 具有体内激活 Notch 信号、挽救骨髓损伤、造血动员、促进髓内外造血重建、倾向性促进髓系造血快速恢复、扩增造血干祖细胞尤其长期造血干细胞、扩增的造血干细胞具有短期造血重建能力的生物学效应。利用生物信息学技术筛选以及体内外实验证实，mD1R 激活 Notch信号途径后能显著上调 Csf2rb2 转录本和蛋白表述；报告基因和染色质免疫共沉淀实验从基因调控水平证实，Notch能识别并结合 Csf2rb2 启动子序列上的 RBP- 结合位点，有效激活Csf2rb2 基因表述，进而活化 Notch 下游 STAT3/Er 生存信号通路，这与 mD1R 抑制造血干祖细胞凋亡而不影响细胞增殖的细胞学机制相互映证。......

参考文献（略）