非平衡等离子体对感染根管细菌生物膜影响的实验研究

第一部分根管消毒封闭对感染根管细菌生物膜影响的实验研究

根管内的微生物及其代谢产物对牙髓根尖周疾病的发生和发展具有十分重要的作用，研究表明根管治疗后，患牙的根管系统若能够保持相对无菌的环境，可以促进根尖周组织的愈合[5]。因此，根管治疗的一个最重要目标是通过进行完善的根管预备和根管冲洗，清除感染根管系统内的细菌[6]。然而，在绝大多数情况下，持续感染的根管系统内仍然会有一些细菌存在。牙本质是一种矿化的有孔的结缔组织，含有牙本质小管结构[7]。某些微生物可以侵入到牙本质小管内，从而免于被根管冲洗和根管封药的灭菌作用清除粪肠球菌属于革兰阳性菌，是一种兼性厌氧球菌，在持续性牙髓根尖周感染的病例中检出率很高。这种细菌对牙本质有很强的附着能力，可以侵入到牙本质小管内形成细菌生物膜，且对根管冲洗试剂和灭菌药物有较强的抵抗性。由此，众多学者经常选择粪肠球菌作为体外建立细菌生物膜模型的代表性菌株。近年来，激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM)常被用来观察牙本质上的细菌和细菌生物膜。Zapata等人用细胞活力焚光染料diacetate和碘化丙徒(propidium iodide, PI)对感染牙本质小管染色，利用CLSM扫描来区分存活细菌和死亡细菌[14]。Parmar等人也用CLSM观察到了感染的牙本质小管内发出绿色和红色突光的细菌[15]。Ma等人在体外建立感染牙本质小管模型，利用CLSM扫描并分析根管冲洗试剂的灭菌效果，以三维图片上红色突光/ (绿色焚光+红色焚光）的体积比值代表感染牙本质小管内生物膜中死亡细菌的比例。随后的相关实验研究仅仅针对了根管冲洗试剂的短期暴露时间[16-18]。6%NaOCl在Imin的处理时间下，能够杀死35%的感染牙本质小管内细菌，即使处理3rnin，死菌比例也只有61%，说明即使经短时间暴露的高浓度灭菌剂处理后，依然有大量活菌存在。然而，目前还没关于于长时间暴露冲洗试剂对感染牙本质小管内细菌生物膜影响的研究。据此，本课题组推测长时间暴露的灭菌剂可以杀死更多的细菌，甚至是消灭全部的存活细菌。

根管封闭材料常被用来闭塞根管系统，以形成整个根管内严密的封闭环境，包括根尖孔、根管不规则区域、及根管内壁与根管充填材料之间的微小缝隙等[19]。因此，封闭材料可以帮助减少渗漏，降低根管内残留细菌侵袭根尖周组织的可能，促进根尖周病损愈合。同时，依然存在于根管内的细菌可以被封闭材料的灭菌成分及根管充填材料释放的Zn2+杀死，或者无法获得其赖以生存的营养物质和增殖空间。早期的研究资料显示，琼脂扩散实验（agar diffusion test，ADT)常用来评估根管封闭材料的灭菌活性[24，25],但是得到的实验数据缺乏可信性[26]。随后，直接接触实验(directcontact test, DCT)代替ADT，可以更真实地反映经标准固化后的根管封闭材料的灭菌效果[27]。可惜的是，DCT也存在一些不足，如没有考虑到牙齿的解剖结构及化学组成等因素对实验结果的影响和不能形成细菌生物膜结构[28，29]。现有的研究资料表明，经DCT的方法分析得出根管封闭材料可以杀死粪肠球菌[25，27，3。],但是迄今为止几乎没有研究资料证实根管封闭材料能够有效清除感染牙本质内的微生物。仅有Saleh等人证实AH Plus和Grossman's可以灭活牙本质小管内的类肠球菌，其渗透深度可达300^im[3i]。综上所述，在本研究中，我们在体外建立感染粪肠球菌生物膜的牙本质小管模型，应用长时间暴露的根管冲洗试剂或联合应用根管封闭材料，利用CLSM观察，软件Imaris分析计算类肠球菌生物膜的死菌比例，评估经灭菌处理后牙本质小管内清除细菌生物膜的效果。

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实验一长时间根管冲洗对牙本质小管内细菌生物膜的影响材料

1.细菌

粪肠球菌（VP3-181)保存于加拿大英属哥伦比亚大学牙学院口腔生物医学中心37°C培养箱。细菌培养于胰酶大豆琼脂(trpticase soy agar, TSA)培养基和脑心浸液（brainheartinfUsion，BHD肉汤培养基中，于37°C的厌氧培养箱中培养。

2.人单根管离体牙

收集于华中科技大学附属同济医院口腔医学中心颂面外科因正畸或其他原因拔除的无明显龋坏、牙髓根尖周病变和畸形的人单根管离体牙24颗。利用刮匙去除牙根表面的软组织和骨碎片，浸泡于0.01%NaOCl中，4°C保存两周，备用。

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方法

1.本实验经华中科技大学附属同济医院医学伦理委员会同意。

2.离体牙根管预备

用牙科低速手机在离体牙的釉牙骨质界（cementoenamel junction, CE)下方1mm处截冠，确保每个圆柱形的牙根长度为4nim。用G钻预备根管至#6，在牙根的断面正中预备一条颊舌向的浅沟，用刀片和锤子沿沟纹勞开，得到半圆柱形的牙根薄片。48个样本的外表面用600目砂纸磨平，以去除牙骨质，且使其厚度约为2mm。精修样本，最终的样本尺寸为4x4x2mm3,并且能够置于含有滤器的离心管内管的底部。牙根薄片分别用5.25%NaOCl和6%梓樣酸(citric acid, CA)超声荡洗4min，以达到去除站污层的目的，然后在无菌去离子水中浸泡Imin。每个半圆柱形样本置于离心管中，根管面向上，用树脂封闭牙齿与离心管内壁之间的缝隙，光照20s,备用。

3.粪肠球菌悬液制备

类肠球菌划线接种于TSA培养基上，置于37°C孵育箱中，过夜培养。收集经过复苏的纯培养的单克隆菌株，混悬于2mL无菌BHI肉汤培养基中，利用酶标仪调整读数为OD4()5=0.05,即此时藥肠球菌悬液的浓度约为3.0xl06CFU/mL。

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第三部分CHX等离子体对感染根管细菌生物膜影响..........57

实验五CHX等离子体对类肠球菌生物膜的影响.........59

材料.........59

方法.........60

结 果.........62

讨论.........63

实验六CHX等离子体对多细菌生物膜的影响.........66

材料.........66

方法.........66

结 果.........66

讨论.........68

实验七CHX等离子体对感染根管内细菌生物膜的影响.........70

材料.........70

方法.........70

结果.........71

讨论.........72

讨论

根管治疗的目标是清除根管系统内的感染物质和防止再感染，并促进根尖周组织愈合[37，38]。机械化学预备的方法可以清除根管内大量的微生物，但是有研究表明在根管治疗完成后，大约50%的患牙根管内仍然有残留的细菌存在[39]。复杂的根管系统具有副根管、管间吻合、侧支根管、根尖分歧和根尖分叉等结构。即使以最严格的标准进行常规的机械化学预备根管、冲洗消毒根管后，完全清除其内附着的微生物也是几乎不可能的事情[4]。SEM观察发现，细菌渗透到牙本质小管内的深度可以达到1000^mi[23],应用常规方法杀灭这些细菌更是困难。另外，进行机械预备时形成的站污层也会降低根管冲洗试剂的灭菌活性，减弱根管封药对牙本质小管的消毒作用[41]。失败的根管治疗病例中，常发现革兰阳性需氧菌和兼性厌氧菌占极大比例，这与以专性厌氧菌为主的原发性感染不同[42 43]。粪肠球菌很少在原发性牙髓根尖周感染中发现，而在根管治疗失败病例中大量存在[4445]，并且表现出对常规灭菌剂具有较强的抵抗性[46，47]。因此，根管消毒是影响根管治疗成功的一个主要因素，探索新的灭菌方法十分必要，以提高根管治疗成功率和患牙保存率。

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结论

1.根管冲洗对感染牙本质小管的灭菌活性有时间依赖性，然而l0min暴露时间以后的灭菌速率显著下降。

2.高浓度NaOCl的灭菌效果更好，明显强于2%CHX和2%NaOCl。在30min暴露时间内，即使反复更新6%NaOCl,也不能完全清除感染牙本质小管内的细菌生物膜。

3.联合应用根管冲洗和封闭材料对感染牙本质小管细菌生物膜的灭活效果最佳。新型根管封闭材料MTA Fillapex杀灭细菌生物膜的能力明显强于AH Plus和BCSealer 0

4.非平衡等离子体能够有效灭活感染根管内粪肠球菌生物膜，可作为根管治疗中控制根管感染的辅助手段，具有良好的临床应用前景。

5.CHX等离子体对粪肠球菌生物膜和感染根管多细菌生物膜都具有良好的灭活作用，可以作为清除根管内细菌生物膜的有效治疗措施。

6.成熟稳重的细菌生物膜具有更强的抵抗性。短时间暴露的CHX等离子体能够杀死55%-70%的感染根管成熟稳重的生物膜细菌。

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参考文献（略）