负载仿生矿化前驱体的介孔硅纳米颗粒再矿化I型胶原的研究

引言

牙齿是人体中矿化程度最高最为坚硬的组织，牙齿的脱矿与再矿化伴随着人的一生。在某些病理性条件下，脱矿速率超过再矿化速率表现为组织中矿物质的流失[1]。饮食中的碳水化合物经致龋性细菌发酵产生乳酸，乙酸或者丙酸，造成牙釉质或者牙本质的脱矿。随着龋坏进展到牙本质，内源性基质金属蛋白酶，半胱胺酸组织蛋白酶被激活导致胶原纤维变性降解，牙本质的机械力学性能随之下降[2, 3]。龋病的防治工作是一项十分艰巨的工程，流行病学调查欧洲成人群体中十人就有九人罹患龋病。单独就美国而言，每年约有10亿美元花费在牙科材料的更换上[4]。尽管预防医学与保存修复学近年来进展显著，但是缺乏耐久性的牙色树脂类修复材料导致每年仍然有大量的齿科充填材料需要替换，特别是牙釉质缺失龋坏进展到牙本质导致结构功能严重破坏的树脂充填修复病例，充填体的使用寿命与功能恢复在这样的情况下会大打折扣[5-7]。除了细菌性来源的龋病导致的牙硬组织脱矿，树脂-牙本质特异的粘接方法也是引起牙本质脱矿的另外一个主要原因[8]。粘接过程中，牙本质有意被酸类物质或者酸性树脂单体酸蚀脱矿暴露胶原纤维基质，以利于亲水性树脂单体渗入胶原结构内形成树脂突，后者通过机械嵌合获得粘接界面的固位力[7，8]。然而迄今为止，尚没有一种树脂单体能完全替换存在于胶原纤维内与纤维外，特别是胶原基质内空隔区域的水份，由于树脂单体的不完全渗透可导致固化后的粘接层呈现疏松多孔性[9-11]。即便能完全替换水分，胶原分子之间有限的分子间距（1. 26-1. 33 nm)仍然难以容纳如二缩三乙二醇（TEGDMA)的小分子尺寸的树脂单体（≈2 nm) 。以往对于粘接界面微观结构的观察不无例外的都是矿物质缺如，胶原纤维稀疏分布，丰富的水分子充斥着在胶原纤维之间的现象[7,10]。受温度，持续做功压力，内源性胶原水解酶对胶原基质的破坏以及树脂渗透不全等综合因素的影响，牙本质/粘接剂混合层的结构完整性易于遭到破坏，粘接性能下降，最终充填体脱落。因此，再矿化脱矿牙本质对于控制龋病进展，增强粘接面的稳定性具有重要意义[9，11]。现已有多种方法尝试用来再矿化脱矿的牙本质。例如，增添含氟化物，添加无定形磷酸钙纳米填料的复合树脂以及含生物活性玻璃纳米颗粒的粘接剂都被用来增强修复体的抗继发龋功能[13, 14]。但是它们当中绝大部分研究都着重于再矿化未完全脱矿的龋坏牙本质，钙与磷酸根离子可随着剩余的籽晶外延性生长，而在无籽晶剩余的条件下这类以离子介导的传统矿化不能发生再矿化[15，16]。因此推测經典的离子介导的矿化成晶理论不适用于再矿化经酸蚀，水洗之后形成的混合层或者微创去龋残留在表面的感染性牙本质，因为这两种情况缺乏可以利用的籽晶[17,18]。应对籽晶缺乏这一问题，拟生态仿生再矿化策略利用仿生类似物稳定的液体样无定形憐酸韩纳米前驱体（amorphous calcium phosphate nanoprecursors)，渗透入脱矿胶原中矿化成晶弥补脱矿造成的缺隙[19-21]。近年研究发现自然界中多种生命体如贝壳，硅藻，海绵动物正是利用这一非經典粒子介导矿化成晶理念实现自身组织的再矿化[22, 23]。胶原纤维内矿化不仅能显著提高胶原基质的力学性能[24-27]，同时还能保护胶原分子免受外界环境如温度影响，细菌性产酸，内源性水解酶等理化刺激。利用仿生再矿化方法，不论是需要酸蚀-水洗的全酸蚀系统[20，28，29]还是相对温和的自酸蚀粘接系统[17, 30, 31]，酸蚀牙本质之后即使形成深达250-300叫的混合层依然能够实现脱矿区域的再矿化[32-34]。这种自下而上(bottom-up)的矿化方法不依赖剩余籽晶的有无，混合层中裸露胶原经再矿化后动态力学性能也可恢复到近乎同完好的矿化牙本质一样，因而可作为延长树脂-牙本质粘接寿命的可利用的机制[35, 36]。本文第一次报导利用具有有序结构的MCM-41型介孔桂纳米颗粒（mesoporoussilica nanoparticles, MSNs)作为由聚两稀酸稳定的液体无定形磷酸韩纳米前驱体(polyacrylic acid stablized amorphous calcium phosphate, Pa-ACP)的转运载体，成功实现I型胶原的再矿化。MCM-41型介孔硅纳米颗粒因为含有合适的孔径大小（平均直径2. 1 nm)，规则平行排列的六边形管状通道，高表面积（>953. 14m2/g)，以及氨基修饰改性后的正电荷特性（17.46 mV)等优异的理化特性，能特异性吸附_pH响应性释放Pa-ACP，释放的Pa-ACP潜在的矿化潜能通过纤维内矿化I型重组装胶原模板得到证实。

第一部分 MCM-41型MSNs与AF-MSNs的合成与表征

过去的一二十年间，表面易于功能修饰化的介孔娃纳米颗粒己发展成为优异的药物转运载体，各类型的介孔娃颗粒通过结构控制与化学性修饰以适应生物科技与生物医学发展的需要[1-3]。相比可降解的有机分子载体工具如树枝状大分子物[4，5]，脂质体[6-8]，这类软性;材料利用环境pH刺激或者其他化学因素诱发自身结构降解破坏达到释放药物的目的，由于材料表现出来的结构不稳定特性，高分子降解产物的生物毒性以及缺乏潜在的药物控释机制，这类载体工具的应用前景并不乐观。相比之下，结构与化学性质稳定的无机物纳米颗粒在生物相容性以及控制药物释放方面显得更加有优势，其中多孔性二氧化桂纳米颗粒因为具有规整的结构，表面异于化学修饰的特性被广泛用作各类药物的控释载体[9-11]。自1992年Mobile公司率先利用表面活性剂作为结构导向剂（structure directing agents, SDAs)合成出M41S型介孔娃纳米颗粒（六边形孔状结构，空间群/56/^7) [12]，此类型的介孔桂纳米颗粒从此被大量应用到催化[13]，分子蹄选[14]，半导体领域[15]，而2001年第一例报导介孔娃纳米颗粒用作控释性药物载体工具更是拓展了其在生物药学等领域的应用空间[16]。本文运用到的阳离子表面活性剂十六焼基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)在第一临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)下形成球形胶束，后者经历自组装生成液晶;（liquid crystal)模板与在碱性催化下水解的正桂酸乙酯相互作用，伴随着桂源的缩聚链合反应形成介孔状结构(有机物模板/二氧化娃）复合物。通过去除模板剂生成的MCM-41型介孔娃纳米颗粒因为本身带负电荷的静电荷特性，为了能更好的吸附聚丙稀酸稳定的无定形磷酸韩(Pa-ACP), MCM-41型介孔娃纳米颗粒在合成之后经过接枝带正电荷的3-氨基丙基三乙氧基娃院(3-aminopropytriethoxylsilane, APTES) [18],以利用吸附带极性负电荷的Pa-ACP。本实验部分将讨论去模板剂后的MSNs与氨基功能化修饰的AF-MSNs的合成方法及其表征，为接下来章节的实验内容作铺垫。

第三部分 AF-MSNs释放Pa-ACP的动力学机制.............59材料...........................59方法...........................60结果...........................64..........72第四部分 利用负载Pa-ACP的AF-MSNs矿化I型胶原.............76材料...........................76方法...........................77结果...........................78全文总结...........................83

第四部分 利用负载Pa-ACP的AF-MSNs矿化I型胶原

胶原内憐灰石晶体的存在不仅能显著提升胶原基质的机械力学性能[1-3],同时可通过抑制内源性酶的活性帮助胶原抵御外界刺激防止变性降解[4，5]。纤维内再矿化无剩余籽晶的胶原纤维已成为现代仿生矿化策略的重要评价标准。现巳有多种方法用来再矿化脱矿牙本质，例如，增添含讓化物，添加无定形憐酸韩纳米填料的复合树脂以及含有生物活性玻璃颗粒的粘接剂都被尝试用来增强修复体的抗继发鍋性能[6，7]。含有由二氧化错稳定的微米级别的ACP颗粒[8],利用喷射干燥法[9]合成的ACP纳米颗粒添加到复合树脂后，这些固态颗粒很难从固化的树脂基质中释放到外界，也难以从粘接剂层扩散到混合层或者鍋病感染的牙本质层[10],包埋的ACP纳米粒子只能作为韩与碟酸根离子的释放来源，后者通过亲水性粘接剂层的水通道扩散到四周。将ACP颗粒添加到牙本质粘接剂中，利用粘接层疏松多孔的可渗透性以及与脱矿牙本质基底缩短的扩散距离可促进该类材料的流动性能，但是它们当中绝大部分研究都着重于再矿化未完全脱矿的銷坏牙本质，韩与憐酸根离子可随着剩余的籽晶外延性生长，而在无籽晶剩余的条件下这类以离子介导的传统矿化不能发生再矿化。因此利用固态ACP纳米颗粒以期实现胶原内的纤维矿化的设想困难重重。利用仿生矿化方法，以粒子介导的非經典成晶途径再矿化脱矿的胶原可很好的实现胶原内矿化晶体的形成，聚合物诱导液体前驱体的方法为这一理论提供了大量成功的例子而广为采用。为了能更加便宜的使用液体前驱体，将已预先自主装的Pa-ACP直接加载到载体工具中相比加入Ca，P与仿生多聚电解质三组成分更加便捷有效，使用效率更容易监测。为了证明经氨基表面改性后的AF-MSNs吸附/释放的Pa-ACP团簇依然保存液体的流动性质以及无定形的非晶特性，重组装的I型胶原纤维被选作快速检验纤维内矿化的胶原模板以证明AF-MSNs转运系统作为Pa-ACP矿化中间物的控释系统是科学可行的。

全文结论

本文围绕以聚合物诱导形成液体样矿化前驱体的合成方法为基础的粒子介导型非經典矿化成晶途径在引导树脂-牙本质粘接混合层中的再矿化机制，通过比较现有的再矿化混合层的材料方法以及矿化机制，探讨了应用溶胶凝胶法合成的介孔砝纳米颗粒作为液体样矿化前驱体的载物工具在矿化I型胶原纤维的可行性，为现有的拟生态仿生矿化方法向临床应用的转化提供了初步实验依据。现有结论如下：1.在stober方法基础上改良的溶胶凝胶法合成MCM-41型介孔桂纳米颗粒具有窄粒径分布以及纳米级别大小的优点，经过后期接枝氣基功能团进行氨基改性能成功的将表面负电荷转为正电荷，利于增强对极性负电荷的无定形憐酸韩的物理吸附。2.介孔硅结构内纳米大小的间隔区域产生的排除体积效应与限域作用对含有无机矿物离子成分/有机多聚酸的复合物具有增强其热力学稳定性能的作用，聚两稀酸稳定的无定形憐酸韩在介孔桂内保持非晶无定形特性是该转运工具可用于胶原再矿化的基础。3.氨基修饰后的介孔硅纳米颗粒因为加强的静电作用力能达到控制载物溢出的作用，而溶液环境中的pH值与离子浓度对于介孔桂释放其内的载物具有重要影响，由此，介孔硅纳米颗粒可作为pH响应型纳米缓释工具控制载物无定形憐酸妈的释放。4.酸性条件下释放的无定形磷酸仍然保持纳米级别大小的颗粒性状，能渗透进入胶原分子之间的间隔中并通过模板效应形成条索状的连续性的憐灰石晶体，因为纤维内憐灰石晶体的物理排除机制以及对胶原酶的抑制作用，树脂-牙本质粘接技术中造成的不良渗透区因此有望实现再矿化，从而增强粘接层的稳定性能。参考文献（略）