低频超声联合抗生素对表层葡萄球菌生物膜渗透性的影响

前 言

术后假体周围感染作为骨科关节置换术后的严重并发症不仅增加了患者的痛苦更给整个家庭、社会带来巨大的经济负担。已有的统计数据显示，初次髋、膝关节置换术后感染率为 1.5-2.5%，而再次翻修术的感染率则高达 3.2-5.6%，仅在美国每年就至少要为此支付数亿美元的医疗费用[1,2]。骨科内植物及其它医疗领域的生物相关材料的感染主要以细菌生物膜（biofilm，BF）的形式存在，有研究报道强调，所有的传染病中，至少有 65%都与细菌 BF 关于[3]。其中表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是最常见细菌[4]。尽管有许多可能的定义，但细菌生物膜可简易描述为一个可根据细菌种类、应变类型和环境条件产生的，由大量自身分泌的多种含有胞外聚合物 EPS（聚多糖、蛋白质、磷壁酸、胞外 DNA 等）的基质及细菌组成的，具有高度组织化的多细胞群体结构[5]。BF 内的细菌通过群体感应（quorum sensing ，QS）进行相互联系及基因调控，并依赖细菌密度释放化学信号和表述毒性基因[6,7]。细菌 BF 的形成由一系列复杂的信号网络系统调控，参与 BF 形成的表述或抑制因子可因细菌种类的不同而影响其细菌密度水平和增长阶段[8]。不同阶段其调控机制、信号表述及致病机理也有显著不同。细菌 BF 这种结构的高度复杂及组织调控的严密性使其能够有效抵抗抗生素、消毒剂、机体吞噬作用和其它宿主先天性、适应性免疫反应及炎症反应系统[9]。有研究表明，形成生物膜的细菌耐药性是浮游细菌的 500-5000 倍[10]。Costerton 等在九十年代就开始强调细菌 BF 的重要性并指出细菌 BF 的形成及其对抗生素的耐药是持续感染和慢性感染的根本原因[11]。

尽管我们对细菌 BF 感染的分子机制有了很大进展，但细菌 BF 耐药的机制仍未完全阐明。意识到细菌 BF 形成不同阶段的特点及已发现的某些 QS 信号系统，提供了一个开发新药及使用亲水或涂有肝素的生物材料以减少细菌的粘附的机会[12-16]，但因引起感染的不同途径及细菌所处周围环境的不同，仅有极少数文献证实了其治疗疗效，尚缺乏足够说服力。临床上，随着植入性生物材料的更广泛应用及细菌生物膜耐药性的增加，单纯的抗生素治疗通常很难有效清除感染，固一旦感染，只能行再次翻修手术治疗，而对于某些不宜替换的生物材料，患者则需要承担更大的感染甚至死亡风险。目前，具有无创伤且被证实有效的可增强联合抗生抗菌疗效的方法包括磁场、电场和低频脉冲超声波[15-18]，其中低频超声已被应用于各种医学领域，包括医疗诊断、医学成像和物理疗法的治疗，其稳定的安全性能使之成为一种最具潜力的新方向。自 Pitt 等[10]首次证实低频超声可显著增强庆大霉素对细菌生物膜的杀菌效力至今，国外已有较多文献研究相关机制，然而由于细菌 BF 本身结构的复杂性及缺乏精密检测仪器和技术等原因，这一效应机制目前仍不清楚。有学者将超声增强抗生素抗菌作用的效应概括为声学生物效应;（bioacoustic effect）[19]。而超声本身对细菌的生存无明显影响。因此本实验目的在于联合低频超声和不同杀菌机制抗生素共同作用，探讨低频超声联合抗生素对表皮葡菌球菌生 BF 渗透性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

表皮葡萄球菌 RP62A 菌株(复旦大学高谦教授赠，重庆医科大学附属儿童医院实验室保存)，金黄色表皮葡萄球菌 25923 菌株（质控菌株，重庆医科大学附属第二医院检验科赠）。

1.1.2 药物及实验试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） （青岛海博生物科技有限公司）

胰蛋白胨大豆肉汤（TSB） （青岛海博生物科技有限公司）

MH 琼脂 （青岛海博生物科技有限公司）

磷酸盐缓冲溶液 （本实验室配制）

药敏纸片

庆大霉素 Gentamicin 10ug CT0024B （英国 OXOID 公司）

头孢噻肟 Cefotaxime 30ug CT0166B （英国 OXOID 公司）

万古霉素 Vanycin 30ug CT0058B （英国 OXOID 公司）

左氧氟沙星Levofloxacin 5ug CT1587B （英国 OXOID 公司）

1.2 实验方法

1.2.1 细菌复苏及分离纯化

（1）常规紫外线消毒 30min；

（2）从-80℃冰箱中取出冻存表皮葡萄球菌菌株，常温解冻；

（3）用微量移液器取少许菌液，与无菌 TBS 液体培养基按 10ul：5ml 比例加入到无菌试管中；

（4）盖上管塞后，置于 37℃、180rpm 摇床中摇菌过夜。

（5）将 TSA 培养基放入水浴中加热至溶化；

（6）待培养基冷却至 55℃左右，按无菌操作倒 2 个平板（每皿约 15ml），平置，待凝固；

（7）右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌,待冷；

（8）无菌操作用灭菌的接种环取菌液一环；

（9）左手持平皿,用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，采用四区划线法进行接种；

（10）划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部加好日期，倒置于 37℃温箱中，培养 48h。

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1 材料和方法 ........ 9

2 实验结果 .......... 13

3 讨 论 ......... 18

3 讨 论

随着对细菌 BF 研究的深入，人们正试图通过各种新方法阻止甚至完全清除与之相关的各种感染。超声作为传统的无创性设备，已广泛安全应用于医学影像、肿瘤、临床实验室等领域，且具有廉价、靶向治疗的优势。治疗超声根据空间和时间场强峰值不同可分为低强度超声（0-3W/cm2）和高强度超声（大于 5W/cm2）。低强度超声的治疗旨在刺激机体生理反应或加速生化过程，而高强度超声的目的是可选择性破坏组织。根据采用频率的不同超声又可分为低频超声（0-800HZ）和高频超声（大于 1MHZ）。超声对于细菌影响的研究可分为几个不同的时期，直到上世纪 90 年代研究人员开始集中探究其在细菌微生物行为方面的影响。现国外已有研究证实超声能促进抗生素渗透进入 BF 内，增强抗生素杀菌效应，但多限于大肠杆菌、铜绿假单胞菌等[10]。本实验中我们观察到表皮葡萄球菌 BF 的形成均不同程度减少了四种抗生素的渗透，研究认为这与细菌生物膜生成胞外基质及胞外多聚物（extracellular polymeric substances, EPS)密切相关[23]。EPS 可为细菌 BF 的形成提供一个凝胶状的三维稳定结构，并通过微环境孔隙度、密度、含水量、电荷、吸附性能等直接影响 BF 内细菌的生存条件。而胞外基质则对 BF 表面的细胞间连接极为重要并抵制宿主免疫系统及抗生素活性，阻止抗生素渗透。越来越多的证据表明，EPS 和胞外基质是细菌 BF 形成必不可少的组成部分，然而现有的研究发现还并不能完全揭开其结构、功能及动态多样性，进一步的了解还需要更加精确和低破坏检测技术的的新方法，这也将有利于我们对细菌 BF 的更好理解。

总结

1. 本实验成功建立了聚碳酸酯膜表面的 48h 成熟稳重表皮葡萄球菌 BF 模型及抗生素渗透膜型。

2. 表皮葡萄球菌 BF 可显著减少庆大霉素(氨基糖苷类)、头孢噻肟（β-内酰胺类）、和万古霉素（多肽类）的渗透性，但对左氧氟沙星(喹诺酮类)渗透性阻碍不明显。

3. 低频超声可不同程度增强抗生素对表皮葡萄球菌生物膜的渗透性。

4. 本实验设计方案可作为一种更快捷、简易且可与相关药敏试验相结合，用于超声联合抗生素对表皮葡萄球菌 BF 有效性研究的新方法。

参考文献（略）