靶向上转换纳米光敏剂构建及其医学应用研究
第 1 章 绪论
引言
肿瘤（Tumor） 的形成是机体受到多种致癌因素影响，导致某一组织细胞失去生长基因控制，异常的克隆复制，从而形成肿瘤组织。在医学领域将肿瘤分为恶性和良性两大类。良性肿瘤表面较光滑，不会侵润到正常的组织内，而且其生长缓慢。癌症最为常见的恶性肿瘤，不仅细胞分裂异常不受控制，而且还会随着体内循环系统或淋巴系统侵入到其他正常组织中，是危害人类健康的重大疾病之一[1-4]。然而在目前医学临床癌症治疗方法是外科手术切除、放疗、化疗，或综合上述疗法，来杀伤癌细胞，但治疗效果有待提高[5-7]。近年来光动力疗法作为一种新的癌症辅佐性疗法，受到人们的广泛研究。光动力疗法是通过注入体内的光敏剂在肿瘤组织中的选择性富集和吸收特定波长的激发光后生成自由基及单线态氧，达到治疗的目的[8,9]。同时光敏剂产生荧光以协助肿瘤的诊断及定位。传统的光动力治疗所用的绝大多数光敏剂为疏水结构，不易在生物体内输运到肿瘤部位，另外光敏剂吸收波长为波长较短的紫外或可见光，由于其组织穿透深度较浅，因此对于体积较大的肿瘤或者位于组织内部较深的肿瘤治疗效果不是很理想[10-17]。稀土掺杂上转换发光纳米材料是具有非线性上转换发光性质的材料。它能将能量较低的长波辐射转化为能量较高的短波辐射，并且具有激发光组织穿透深度大、光学性质稳定、荧光背景低、不易漂白等特点，这些特性使其在生物医学领域，比如生物标记、多模成像、光动力治疗、药物输运等方面展现出一定的应用前景[18-23]。
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1.2 稀土上转换发光纳米粒子的基本理论
1.2.1 稀土上转换发光机理
上转换发光材料是通过发光中心离子连续吸收两个或多个光子，然后通过无辐射弛豫过程布居到发光能级，再由此能级跃迁到基态，放出一个光子的双光子或多光子过程。为了达到双光子或多光子效应，作为发光中心离子的亚稳态能级寿命要相对较长。稀土离子能级 f-f 跃迁是禁戒的，因此有较长的寿命、符合双光子过程条件[24]。以三价稀土离子为例，见图 1-1。这样密集的能级间产生跃迁形成范围广阔的光谱，其光谱区域可布满由紫外到红外区域。除 f-f 跃迁外，还有 4f-5d,4f-6s,4f-6p 电子跃迁。由于 5d,6s,6p 能级处于更高的能级位置，所以跃迁波长较短。由于 4f 壳层受到 5s2,5p6壳层的屏蔽作用，使得其受外场作用影响不大，所以在固体中其能级和光谱都具有原子现实特征。而在稀土光谱中的电荷迁移带吸收位于紫外或者真空紫外，并且光谱成宽带，是通过配体电荷迁移到稀土离子，稀土离子和配体空穴形成电荷迁移态的所形成的[25]。
第 2 章 NaYF4:Yb3+,Er3+上转换发光纳米粒子的可控合成、相转移与表征
2.1引言
稀土掺杂上转换纳米粒子可以通过发光中心离子连续吸收两个或者多个光子，将长波辐射转化为短波辐射。稀土离子能级之间的跃迁属于禁戒的 f-f 跃迁，因此有较长的能级寿命，这是实现上转换双光子或者多光子过程的必要条件。三价稀土离子具有密集的激发态能级，因此可以跃迁形成波长范围广的发射光谱，其光谱区域可布满由紫外到红外区域。并且在发光性质上具有发光谱线窄，发光性质稳定等显著的优点，因此被广泛的用于生物荧光标记、深度组织成像、光动力治疗等领域的研究[67-75]。与下转换荧光材料如量子点、有机染料等相比，稀土掺杂上转换纳米粒子具有生物安全性高、荧光背景低、组织穿透深度大等特点[76-78]。同时，根据应用的需要可以在基质中掺杂不同的稀土发光中心离子，实现多色标记与成像。目前上转换纳米粒子在生物应用中面临的主要两大问题就是上转换发光效率低和生物相容性差。上转换纳米粒子的发光效率一般在千分之几的量级，所以要想实现安全有效的生物应用需要合成发光效率较高的上转换纳米粒子。目前提高上转换发光效率的方法主要有两种，一是通过分区掺杂发光中心离子，避免发光中心离子之间的交叉弛豫；二是通过表面壳层包覆，钝化纳米粒子表面缺陷，从而降低无辐射过程几率，提高发光效率。另一方面，稀土发光中心离子有许多发光能级，可以作为多功能生物应用的材料。如何实现稀土掺杂上转换纳米粒子各个发光谱带的强度的调控具有重要的意义。在过去的几年里，为了制备发光效率高、生物相容性好的上转换纳米粒子，人们深入的研究了稀土掺杂上转换材料的发光机理，发展了许多制备上转换纳米粒子的合成方法[79-84]，如高温热分解法、水热法、溶胶凝胶法、共沉淀法等。
2.2 实验材料
（1）氧化镱（Yb2O3，99．999％），氧化钇（Y2O3，99．999％），氧化铒（Er2O3，99．999％），来自长春应化所稀土实验室；
（2）硝酸钇 Y(NO3)3(aq) 0.1M，硝酸铒 Er(NO3)3(aq) 0.1 M，硝酸镱Yb(NO3)3(aq) 0.1 M，由硝酸和稀土氧化物制得；
（3）氟化钠 NaFAR，氢氧化钠 NaOHAR、氟化铵 NH4F AR、硝酸 HNO3GR、丙酮、无水乙醇、甲醇、四氢呋喃、环己烷、盐酸，N，N-二甲基甲酰胺、二乙二醇（DEG）购于北京化工厂；
（4）三氟醋酸钇（（CF3COO）3Y）、三氟醋酸镱（（CF3COO）3Yb）、三氟醋酸铒（（CF3COO）3Er）、三氟醋酸钠（CF3COONa），荧光胺（ 4-Phenylspiro-[furan-2(3H)）Flua 公司；
（5）氯化钇 YCl3•6H2O (99.9%), 氯化镱 YbCl3•6H2O (99.9%)、氯化铒ErCl3•6H2O (99.9%)、油胺（OM）、油酸（OA）、十八烯（ODE）、聚丙烯酸（PAA）（Mv=1700）、聚乙烯亚胺（PEI）（Mv=2000）、聚丙烯胺（PAAM,20wt%水溶液）（Mv=17000），购于 Sigma 公司；
（6）实验用水为去离子水，其电阻率为 18.2MΩ•cm；
第 3 章 物理吸附法构建上转换光敏剂纳米平台.....51
3.1 引言..... 51
3.2 实验材料....... 52
3.2.1 实验试剂 ........ 52
3.2.2 实验仪器与表征 ........ 52
3.3 实验步骤....... 53
3.4 结果与讨论..... 56
3.5 本章小结....... 68
第 4 章 共价单载光敏分子的上转换纳米光敏剂构建.......69
4.1 引言..... 69
4.2 实验部分....... 70
4.2.1 实验试剂 ........ 70
4.2.2 实验仪器与表征 ........ 71
4.3 实验步骤....... 72
4.4 结果与讨论..... 75
4.5 本章小结........ 93
第 5 章 共价双光敏剂上转换纳米平台的构建...... 95
5.1 引言..... 95
5.2 实验部分....... 96
5.2.1 实验试剂 ........ 96
5.2.2 实验仪器与表征 ........ 96
5.3 实验步骤....... 96
5.4 结果与讨论..... 98
5.5 本章小结...... 106
第5章 共价双光敏剂上转换纳米平台的构建及其光动力治疗研究
5.1 引言
结论
近几年，癌症对人类健康的影响日趋增大。随着纳米技术和分子生物学研究的不断发展，两个学科有机结合发展衍生出一个新兴的领域：纳米生物技术。纳米生物技术受到人们的广泛研究和关注[112-120]。稀土掺杂上转换纳米粒子（UCNPs）具有通过近红外光激发产生短波发射的特性，由于其诸多的优点已经发展成为一类新兴的荧光生物探针和光动力治疗纳米材料。和下转换荧光材料如：传统的有机染料（如 Cy5）、半导体量子点（如 CdSe）等相比，上转换纳米粒子通过近红外光激发，使得其对生物组织的损伤较小，另外其具有很强的组织穿透能力，同时不会激发组织自身荧光，因此上转换荧光成像具有较高的灵敏度，以上优点是上转换材料应用于生物医学研究的基础。另外，上转换纳米粒子本身毒性低、易于化学修饰的特点，使其在癌症的诊断与治疗领域引起了广泛的研究兴趣。目前人们已对上转换发光纳米粒子的研究从化学合成与制备逐渐延伸到生物医学的不同领域，如均相免疫检测、光动力治疗、多模成像等。但是这些研究中还存在着诸多问题，如上转换纳米粒子的发光效率低、表面生物功能化后的稳定性差、肿瘤靶向性差、光动力治疗单线态氧产量低等等。本论文中，我们通过设计和改变不同核壳结构、稀土掺杂比例，制备了粒径均一可控、结晶性好、发光效率高的 NaYF4:Yb3+,Er3+稀土上转换发光纳米粒子；并利用胺基聚合物对合成的油相上转换纳米粒子进行了表面修饰改性。在此基础上，围绕提高单线态氧产量、降低辐照光功率密度、避免 980nm 激光热效应的目的，我们分别通过物理吸附、共价偶联的方式对纳米粒子进行光敏剂的组装，构建了同时具有诊断和治疗功能的上转换发光复合纳米粒子，极大的提高上转换光敏纳米粒子的单线态氧产量，降低了辐照光功率密度，并实现了对体外肿瘤细胞的靶向标记和荷瘤鼠动物模型的在体光动力治疗。
参考文献（略）