环磷酰胺损害未成熟稳重睾丸血睾屏障的机制及防护研究

第一部分环磷酰胺对未成熟稳重睾丸支持细胞紧密连接的影响

血-睾屏障是睾丸间质内的毛细血管与生精小管之间存在的结构总称,其中支持细胞间的紧密连接是构成血-睾屏障最主要结构基础。课题组在前期的实验研究中，观察到环磷酰胺可导致生精上皮变薄，Sertoli细胞分布稀疏，细胞间隙扩大，提示间紧密连接被破坏，BTB受损，但其机制尚不清楚。本实验采用CP化疗损伤未成熟稳重睾丸大鼠模型，探讨环磷酰胺对未成熟稳重睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白的影响。1 材料与方法1.1 实验材料与试剂8d 龄雄性 SD 大鼠 重庆医科大学实验动物中心环磷酰胺（CP） 江苏恒瑞医药股份有限公司兔抗鼠 F-actin 抗体 北京博奥森生物技术有限公司兔抗鼠 occludin 抗体 北京博奥森生物技术有限公司兔抗鼠 ZO-1 抗体 北京博奥森生物技术有限公司SP 法免疫组化试剂盒 北京博奥森生物技术有限公司蛋白酶 Amersco胰蛋白酶消化液 北京博奥森生物技术有限公司DAB 显色剂 北京博奥森生物技术有限公司多聚赖氨酸 SigmaPBS 及枸橼酸盐缓冲液 北京博奥森生物技术有限公司LEICA RM2135 切片机 GermanyOlympus 光学显微镜 apanBHW-Ⅳ型电热恒温水浴箱 北京医疗设备厂.......1.2 给药方法1.2.1 动物分组选取 14d 龄雄性 SD 大鼠共 40 只，设置实验组及对照组，每组 20 只。1.2.2 药物剂量及给药方法实验组 CP 给药剂量为 75mg/g（相当于人类儿童临床常用量 12mg/g），CP的配置浓度：10mg/ml。对照组注射等量的 NS。实验组和对照组均采用一次性腹腔注射。并于给药后 24 小时处死大鼠进行检测。......2 结果2.1 电镜检测结果对照组可见支持细胞连接处光滑清楚，走行自然（图 1.1A, 图中用红色椭圆着重标注）；而处理组连接处细胞膜分离，其间出现较大间隙，连接旁内质网也出现程度不等的扩张（图 1.1B，图中用红色椭圆着重标注）。......2.2 免疫组化检测 Occludin 及 ZO-1 的表述情况免疫组化染色显示：Occludin 及 ZO-1 阳性物质均定位于细胞浆，呈棕黄色。两者各自的对照组与处理组比较差异没有显著性意义（P>0.05，图 1.2：Occludin的表述情况；图 1.3：ZO-1 的表述情况）。......第三部分 银杏黄酮对支持细胞骨架损伤及细胞凋亡的保护作用..... 421 材料与方法 ........................................... 422 结果 .................................................. 433 讨论 ................................................... 45第三部分银杏黄酮对支持细胞骨架损伤及细胞凋亡的保护作用银杏黄酮不仅具有良好的抗氧化作用，而且对肿瘤细胞的增殖有抑制作用，因而在患者使用 CP 化疗过程中辅助使用银杏黄酮，则不仅可以增强抗肿瘤的效果，还有可能对机体起到抗氧化保护作用。本课题组前期的研究发现：银杏黄酮可提高 Sertoli 细胞的抗氧化能力，清除氧自由基，使细胞免受损伤。那么，银杏黄酮的抗氧化保护能否对抗ACR所致的细胞骨架损伤及细胞凋亡？目前尚无文献报道。故本部分进一步采用分离培养未成熟稳重大鼠睾丸的 Sertoli 细胞模型，检测了银杏黄酮对 ACR 处理后 Sertoli 细胞骨架及细胞凋亡的影响，探讨银杏黄酮保护血睾屏障的可能机制。........全文总结本课题采用未成熟稳重SD大鼠CP化疗模型及原代培养的未成熟稳重大鼠睾丸的Sertoli细胞，从体内体外两个方面探讨CP及其代谢产物ACR对未成熟稳重睾丸血睾屏障损伤的机理，并在此基础上探讨银杏黄酮对支持细胞凋亡及细胞骨架损害的保护作用，主要结论如下：1.环磷酰胺对血睾屏障的紧密连接有明确的影响，其可导致连接处细胞膜分离，其间出现较大间隙，连接旁内质网也出现程度不等的扩张，导致紧密连接瓦解，血睾屏障被破坏。2.环磷酰胺及其代谢产物丙烯醛可能通过干扰支持细胞骨架并诱导细胞凋亡来破坏血睾屏障的稳定性。.......参考文献（略）