根管内感染防治医学新技术的相关研究

前 言牙髓、根尖周病是最常见的口腔疾病之一，他们可以造成患者的极度不适感、颌面部疼痛和牙齿缺失等危害；还能影响患者的身心健康并降低患者的生活质量[1]。此外，牙髓、根尖周病还有可能作为系统性疾病（如细菌性心内膜炎和心血管疾病）的感染源[2, 3]。大量研究报道，细菌及其代谢产物是牙髓、根尖周病的主要病因之一[4, 5]。当前，治疗牙髓、根尖周病疗效最好的方法是根管治疗。根管治疗的目的是清除根管内感染并对根管进行彻底的消毒，继而对根管系统进行三维严密的充填，最终促进根尖周组织的愈合[6]。完全清除根管内感染对根管治疗成功至关重要。目前，实现这一目标主要借助各种各样的物理-化学根管消毒技术[7, 8]。当前，次氯酸钠（NaOCl）是最常用和最有效的根管冲洗剂。它具备很好的溶解有机组织的能力和有效的根管消毒作用[9]。然而，单独使用 NaOCl 冲洗根管只能清除侵入牙本质小管内 130 微米深度以内的细菌[10, 11]。而顽固性根管感染可以发生在牙本质小管内超过 300 微米甚至深达 1000 微米的深度[11]。研究发现，被动超声冲洗（PUI）技术能显著增强 NaOCl 的根管消毒作用[12]。但是，PUI 在弯曲根管内的应用会受到限制。因为在应用 PUI 进行根管消毒时，根管的根尖端需要预备至至少#35-40 以允许超声工作尖被置于距根尖孔 1-2 毫米的位置[13, 14]。大量研究报道，激光辐射本身或者激光辐射结合不同根管冲洗剂（激光辅助根管消毒技术）均可在不同感染模型上取得满意的杀菌作用[15]。目前，研究比较多的激光系统主要包括 Nd:YAG 激光，Er:YAG 激光，Er,Cr:YSGG 激光和光动力杀菌治疗技术（aPDT）[16, 17]。关于比较不同激光辅助根管消毒技术杀菌作用的研究已有报道，但是这些研究中所用感染模型是牙本质片；它并不能反映他们在根管环境内的真实杀菌作用。作为根管治疗的最后一个步骤，理想的根管封闭材料应该能对根管内残存的细菌起到有效的杀灭作用或者抑制作用。目前大多数常用根管封闭材料仅具备一定的短期杀菌作用；这是由于他们在完全固化前可以释放出一些杀菌成分。比如，氧化锌丁香油类（ZnOE-based）根管封闭剂固化前能释放丁香油；环氧胺树脂类根管封闭剂固化前能释放甲醛和双酚 A[18, 19]。但是，随着抗菌成分的消耗，这些根管封闭剂的杀菌作用就会数小时到数天内丧失。与此同时，上述抗菌成分的释放也有可能对细胞或者组织产生不同程度的毒性作用；还有可能影响封闭剂的封闭效果[20]。目前，已有很多学者进行多种尝试以增强现有根管封闭剂的抗菌作用。其中最常用的方法就是向根管封闭剂内添加抗菌组分（如氨苄青霉素和甲硝唑）[7]。但是这些新;的根管封闭材料仅表现出增强的短期杀菌作用，而长期杀菌作用并无改善。还有研究将阳离子颗粒和银离子与根管封闭剂进行混合，结果发现虽然短期杀菌作用增强了，但是生物相容性却变差了[21, 22]。目前，研发一种同时具备长期有效杀菌作用和良好生物安全性的根管封闭材料依然是一项很大的挑战。因此，本课题的主要目的是探索和发展一些新的根管内感染防治技术，为提高根管治疗成功率、维持根管治疗远期疗效和预防根管治疗失败提供新的思路和技术理论支持。一方面，我们比较研究了【Nd:YAG 激光，Er:YAG 激光，Er,Cr:YSGG 激光和光动力杀菌治疗技术（aPDT）】等几种激光辅助根管消毒技术在体外离体牙根管感染模型中的消毒作用；并对其中消毒作用最好的 Er:YAG 激光辅助 NaOCl 冲洗技术的工作参数进行了优化研究，即比较了不同输出功率（0.3、0.5 和 1.0 W）和不同照射时间（20 和 30 s）条件下 Er:YAG 激光辅助 NaOCl 根管消毒技术在体外离体牙根管感染模型中的消毒作用。另一方面，我们研制合成了一种季铵盐化二氧化硅生物玻璃纳米微球抗菌根管封闭剂基质材料（SBG-QAPMs）；并测定了 SBG-QAPMs的水溶性及离子释放能力、对感染根管内常见顽固性致病菌的杀菌作用和生物安全性（体外细胞毒性作用和体内炎症反应作用），以明确其用于新型长效抗菌根管封闭剂研发的可行性。..........文 献 回 顾一．微生物感染与牙髓、根尖周病人类对牙髓、根尖周病病因的探索最早可以追溯到大约四五百年前。中国人提出了最早的假说，即虫牙;假说，这一假说一直持续到 18 世纪中叶；后来被hollowtube theory;所替代[23]。1894 年，Miller 发表了关于感染根管内微生物研究的成果[24]。但是，由于检测技术的局限性，早期检测出来的根管内微生物大多为革兰氏阳性兼性厌氧菌。直到 20 世纪七十年代，随着微生物检测技术的突飞猛进，人们发现实际上根管内感染微生物以专性厌氧菌为主。根管内微生物不同于口腔内微生物。口腔正常菌群种类高达 500 种以上，但从根管内分离培养出来的细菌只有 150 种左右[25]。髓腔和根管被牙釉质/牙骨质和牙本质所包绕，正常情况下主要以根尖孔与外界相通，进行营养物质交换。微生物想要侵入到根管内，必须通过牙釉质/牙骨质和牙本质以及宿主免疫反应等重重考验。此外，即便是侵入到根管内，由于根管内有限的生存空间、有限的营养成分、有限的氧分，微生物之间必须进行激烈的竞争，或者通过一些改变来适应这样的环境，比如基因交换、基因突变和自我修饰功能等等[26]。因此，尽管口腔内所有细菌都有可能侵入到根管内，但是只有一小部分可以被检测出来。根管内感染一般是细菌混合感染（大约 2-10 种不同细菌），微生物总数量从 103-107不等[27]。根管内感染微生物群以革兰氏阴性专性厌氧菌为主，但是也可见革兰氏阳性兼性厌氧菌。此外，原发性和继发性根管内感染微生物种类有所差别。前者由 G+菌和G-菌（约为 1:1）共同引起[28]；而后者主要由 G+菌引起[29]。死髓牙根管中产黑色素（blac -pigmented）菌的数量最多，包括具核梭杆菌（Fusobacterium nudeatum）和微小消化链球菌（Peptostreptococcus micros）等[30, 31]；有症状牙髓感染中检出率比较高的包括中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）、牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonasendodontalis）、牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和变黑普氏菌（Prevotellanigrescens）[32-34]；而根管治疗失败病例中检出率最高的则是肠球菌属（Enterococcusspp. ）[35]。此外，感染根管内还可以检出放线菌属（Actinomyces）、螺旋菌属（spirochetes）、念珠菌属（Candida）和乳酸菌属（Lactobacillus）等等。产黑色素菌属于革兰氏阴性专性厌氧菌，常见于感染根管内和根尖周脓肿中；它在感染根管内的检出率为 13%-50%；它的致病性与其菌毛、菌囊、外膜蛋白和内毒素脂多糖关于[36]。感染根管内检出率比较高的普雷沃菌属包括变黑普雷沃菌和中间普雷沃菌。他们在感染根管内的检出率为 13%，在根尖周炎根管中检出率为 26%~40%[37, 38]。感染根管内其他产黑色素菌如牙龈卟啉单胞菌和牙髓卟啉单胞菌的检出率分别是 43%和 28%[37]。肠球菌属在初次感染根管内检出率相对较低，但是在再次感染根管（根管治疗失败病例）内检出率为 24-77%[35]。它的致病性与其分泌的毒力因子如细胞溶素和白明胶酶[39]、粘附因子如聚集物质、肠球菌表面蛋白和胶原蛋白[40-42]和表面结构如细胞膜脂多糖[43]等等关于。..........二．根管内感染防治当前，治疗牙髓、根尖周病疗效最好的方法是根管治疗。根管治疗的目的是清除根管内感染并对根管进行彻底的消毒，继而对根管系统进行三维严密的充填，最终促进根尖周组织的愈合[6]。无论是初次感染根管还是再次感染根管，完全清除根管内感染对根管治疗成功都至关重要，这也是根管治疗过程中的一个难点和挑战。以上提及，根管内微生物可以形成细菌生物膜并且可以侵入到根管系统的深层部位（如牙本质小管内）[11]。Bystrom 和 Sundqvist 等研究了机械预备对根管内感染清除的效果，结果发现机械预备结合生理盐水冲洗可以使根管内细菌大量减少；但是在第一次复诊时细菌培养就呈阳性了[27]。他们还发现，如果将生理盐水换成 NaOCl 溶液或者 NaOCl 结合 EDTA 溶液，细菌清除效果就大大提高了[59, 60]。由于根管系统解剖结构的复杂性和空间局限性，单纯的机械预备很难完全清除位于根管峡部、根管分叉、侧副根管、不规则区和牙本质小管内等区域的细菌[57, 58]。因此，除了根管机械预备之外，清除或者控制根管内感染主要通过根管冲洗消毒技术、根管内封药和根管充填来实现[6]。..........实验三 季铵盐化二氧化硅生物玻璃纳米微球抗菌根管封闭剂基质材料的抗菌性能测定.....641 材料.... 641.1 主要实验仪器 ........641.2 主要实验试剂 ........652 方法.... 652.1 测试方法和菌株 ............652.2 细菌复苏和培养 ............652.3 ADT ......662.4 DCT ......662.5 统计学分析 ...........673 结果.... 673.1 SBG-QAPMs 在 ADT 中的杀菌效果 .......673.2 SBG-QAPMs 在 DCT 中的杀菌效果 .......684 讨论.... 69实验四 季铵盐化二氧化硅生物玻璃纳米微球抗菌根管封闭剂..........721 材料.... 721.1 主要实验仪器 ........721.2 主要实验试剂 ........732 方法.... 732.1 SBG-HA 的体外细胞毒性测定........732.2 SBG-HA 的体内炎症反应测定........752.3 统计学分析 ...........763 结果.... 773.1 SBG-HA 的体外细胞毒性作用........773.2 SBG-HA 的体内炎症反应作用........784 讨论.... 79实验四 季铵盐化二氧化硅生物玻璃纳米微球抗菌根管封闭剂基质材料的生物安全性测定实验三部分比较了四种 SBG-QAPMs（SBG-PA、SBG-NA、SBG-HA 和 SBG-OA）和三类代表性根管封闭材料产品（Endomethasone C、AH Plus 和 ProRoot MTA）对三种常见的感染根管内顽固性致病菌（粪肠球菌、变形链球菌和血链球菌）的杀菌作用。结果显示在 28 天的实验周期内，三类代表性根管封闭材料产品只有新鲜制备的样本（制备后 24 小时以内）对三种测试菌有有效的杀菌作用；而四种 SBG-QAPMs在 28 天的实验周期内对三种测试菌均有有效的杀菌作用，其中又以侧链烷基长度CL = 16 的 SBG-HA 杀菌作用最强。临床进行根管治疗时，根管封闭材料难免会被推出根尖孔而与根尖周细胞和组织发生接触。那么，这就要求根管封闭材料应该具备良好的生物安全性，以免对根尖周细胞或者组织造成损伤等副作用，避免延缓组织的愈合进程和降低根管治疗的成功率。因此，本实验部分的目的是测定以 SBG-HA为代表的 SBG-QAPMs 的生物安全性，包括体外细胞毒性测定和体内炎症反应测定。........1 方法以三类代表性根管封闭材料产品（Endomethasone C、AH Plus 和 ProRoot MTA）作为对照，SBG-HA 的体外细胞毒性测定应用死活细胞染色法（LIVE/DEAD staining）和 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐染色分析法（MTT assay）。本实验部分所用牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）由美国宾夕法尼亚大学施松涛教授馈赠。无菌条件下将第二代牙周膜干细胞冻存株 37℃恒温水浴箱中快速解冻。将解冻后细胞悬液接种于 10 毫升不含维生素 C，含 10% FBS和 1%双抗的 α-MEM 培养基中。37℃条件下，含 5% CO2 湿润孵育箱中孵育培养。每两天更换培养基一次。所得第四至六代牙周膜干细胞用于后续实验。将新鲜制备的材料样本（SBG-HA、Endomethasone C、AH Plus 和 ProRoot MTA）置于 α-MEM 培养液中，37oC 条件下孵育 24 小时以制备材料浸提液。依据国际标准化组织（ISO）标准，样本表面积与培养液体积的比率控制在 0.5 cm2/mL[20]。将制备的浸提液使用孔径为 0.2 微米的滤器进行过滤，滤液用于细胞培养。

......小 结本课题的主要目的是探索和发展一些新的根管内感染防治技术，为提高根管治疗成功率、维持根管治疗远期疗效和预防根管治疗失败提供新的思路和技术理论支持。一方面，我们比较研究了目前已经被用于牙髓治疗的几种激光辅助根管消毒技术【Nd:YAG 激光，Er:YAG 激光，Er,Cr:YSGG 激光和光动力杀菌治疗技术（aPDT）】在体外离体牙根管感染模型中消毒作用；同时，我们还对以上几种激光辅助根管消毒技术中消毒效果最好的 Er:YAG 激光辅助 NaOCl 溶液根管消毒技术进行了工作参数（输出功率和照射时间）的优化研究。另一方面，我们研制合成了一种季铵盐化二氧化硅生物玻璃纳米微球抗菌根管封闭剂基质材料（SBG-QAPMs），并对其水溶性及离子释放、抗菌作用和生物安全性等特性进行了测定，以期明确其用于新型抗菌根管封闭剂研发的可能性。综合本研究实验结果，初步结论如下：一、 目前常用激光辅助根管消毒技术【Nd:YAG 激光，Er:YAG 激光，Er,Cr:YSGG激光和光动力杀菌治疗技术（aPDT）】在体外离体牙根管感染模型中均具备有效的根管消毒作用；其中又以 Er:YAG 激光辅助 NaOCl 溶液根管消毒技术效果最好。二、 当 Er:YAG 激光输出功率增加和/或者工作时间延长时，Er:YAG 激光辅助NaOCl 溶液根管消毒技术根管消毒作用会增强。当输出功率为 0.5 瓦特、工作时间为30 秒钟时，Er:YAG 激光辅助 NaOCl 溶液根管消毒技术可以完全清除根管壁表面和牙本质小管内 500 微米深度以内的细菌。除此之外，Er:YAG 激光在工作时它的光纤头是放在根管口下方 1 毫米左右的位置而不需要插入到根尖孔附近。因此，它可以用于各类根管（直根管和弯曲根管等）的消毒。综上，Er:YAG 激光辅助 NaOCl 溶液是一种有效的、应用前景广的根管消毒技术。三、 本课题所研发的 SBG-QAPMs 在 PBS 溶液中的稳定性极好、可以释放微量矿化相关离子（Si4+和 Ca2+）、具备长期稳定有效的杀菌作用和良好的生物安全性。因此，SBG-QAPMs 可以用于新型抗菌根管封闭剂的研发。..........参考文献（略）