IRES依赖型翻译增强双抑癌基因医学表述载体对肿瘤的疗效

第 1 章 文献综述1.1 真核细胞蛋白质翻译起始机制基因编码合成具有功能的蛋白质的过程，受到多个方面的调控如：DNA 修饰、转录、翻译、mRNA 代谢、mRNA 或蛋白质定位以及蛋白质稳定性等。其中任何一个步骤的失调都会导致基因表述异常。其中转录调控和翻译调控在基因表述过程中起着重要的作用。但蛋白质组学和转录组学等一列研究显示，mRNA转录本与蛋白质水平之间的相关性十分低，mRNA 的转录效率和它的翻译效率通常并不相等[1]，这说明蛋白质表述很大程度上受到转录后或翻译后的调控。研究显示翻译水平的调控是基因表述调控重要环节之一，在细胞生长、分化、凋亡和血管生成方面起着重要作用[2, 3]。因此，翻译的失调会导致细胞发生很多病理性变化[4-6]。1.1.1 帽依赖型翻译起始机制真核细胞内绝大多数 mRNA 的翻译起始是帽依赖型机制，通过这种机制进行翻译起始的 mRNA 可占细胞内总 mRNA 的 95%-97%[7]。在这一机制中，首先，翻译起始 tRNA（Met-tRNAiMet）与 40S 核糖体亚基结合，形成 43S 前起始复合物；接着，43S 前起始复合物与真核翻译起始因子 4F（euaryotic translationinitiation factor 4F，eIF4F；由 eIF4E、eIF4A、和 eIF4G 组成，能专一地识别 mRNA5端帽结构）结合，通过 eIF4F 识别 mRNA 5末端帽结构，并于 mRNA 结合形成 48S 起始复合物；然后，48S 起始复合物由 mRNA 5端向 3端滑行，当 48S起始复合物遇到并识别起始密码子 AUG 时，招募 60S 核糖体亚基，最终形成 80S翻译起始复合物，引导真核细胞蛋白质合成开始[8-11]。这一模式称为帽依赖型翻译起始机制。这一模式中，43S 起始复合物形成过程中有一种蛋白因子 eIF4E，能够专一地识别 mRNA5端的帽结构，与 mRNA 的 5端结合形成蛋白质-mRNA 复合物，并利用该复合物对 eIF3 的亲合力与含有 eIF3 的 40S 核糖体亚基结合。除了帽结构以外，48S 起始复合物还能识别 mRNA 上的起始密码子 AUG。之所以 48S 起始复合物能在 AUG 处停下，可能是由于 Met-tRNAiMet的反密码子与 AUG 配对的结果。这一模式意味着 40S 核糖体亚基不能结合在 mRNA 核苷酸链内部的起始密码子上。也即是说，一旦核糖体完成某一蛋白质的合成，即从 mRNA 上分离下来，并重新识别结合于 mRNA5末端帽结构，而不是识别 mRNA 下游的起始密码子。在一些短的开放阅读框或某些特殊情况下，多肽合成结束后，转录起始复合体接着启动下游顺反子的翻译也是可能的，但这是一个十分低效的过程。这些特性也解释了为什么真核细胞中 mRNA 绝大多数是单顺反子结构[12]。虽然在大多数情况下这种模式在真核生物细胞中占主导地位，但在许多压力条件下，这种翻译起始模式会受到抑制，并且细胞总蛋白合成会显著降低[13-16]。然而在蛋白质合成受抑制时，细胞会有选择性的翻译对细胞存活至关重要的和能够抵抗压力条件的 mRNA 进行翻译[13-15]。这些压力应答蛋白的合成通过其他翻译起始机制进行。........1.2 肿瘤的基因治疗目前，肿瘤仍然是影响人类健康的重要疾病之一。今天科学家已经能够对许多种肿瘤做出早期诊断，延长患者的生存期。但由于肿瘤发病率高、复发率高、死亡率高，并且缺少有效的治疗手段，人类并未从根本上治疗这类疾病。20 世纪 50 年代以来，对肿瘤医学的研究有三项最为突出的成就：（1）癌基因的发现及其研究的深入；（2）染色体畸变与致癌基因表述相互关系的揭示；（3）抑癌基因的发现及表述调控。至今已经发现了上百个原癌基因的许多抑癌基因，证明细胞癌变的分子基础是基因突变，DNA 的变化和不正常活动导致了细胞癌变。传统的手术治疗、化学药物治疗及放射治疗对于肿瘤晚期的转移不能起到很好的抑制作用，并且化学药物和放射线对正常细胞也会造成很大伤害。所以随着对肿瘤发生发展研究的深入及基因转移技术研究的深入，基因治疗成为治疗肿瘤最具希望的方法。基因治疗是通过分子生物学的方法，将外源正常基因导入靶细胞并有效表述，纠正因基因缺陷或表述异常，达到治疗疾病的目的。肿瘤基因治疗的基本程序主要包括治疗基因的选择、高效且安全的基因转移载体的选择、及调控目的基因在靶细胞中的表述。把治疗基因导入靶细胞的过程，是基因治疗的一个重要环节。基因转移的方法有病毒载体转移方法和非病毒载体转移方法。非病毒载体转移方法包括脂质体法、直接注射法和受体介导基因转移等方法[58-60]。但目前最有效研究最广泛的是病毒载体转移方法。用于基因治疗的病毒载体应具备一些基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表述；（3）对机体没有致病力。因为大多数野生型病毒可通过在细胞中复制而导致细胞裂解死亡，或带有病毒癌基因而使细胞发生恶性转化；所以必须对病毒进行改造，使其成为复制缺陷型病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。........第 2 章 制备重组腺病毒 Adp14ARF 并与重组腺病毒 Adp53联合应用对人结肠癌细胞 DLD-1 的影响2.1 前言如今肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已成为人类重大疾病之一。目前临床上治疗肿瘤的手段仍以手术切除辅以标准化疗和放射治疗为主，常用的化疗药物有铂类与紫杉烷类，但这些化疗药物对某些具有耐药性的肿瘤治疗效果不理想；且化疗药物和放射线的应用对于患者机体的正常组织器官会造成损伤，引起严重的副作用。随着对肿瘤生物学和肿瘤发生转移机制研究的深入，针对肿瘤发病机理进行基因治疗成为目前研究的新领域。肿瘤的发生常伴有原癌基因活化或抑癌基因失活，且涉及多个基因和通路的改变。研究显示超过 50%的肿瘤中抑癌基因 p53 发生突变或缺失[116-118]，而约 40%的肿瘤中抑癌基因 p14ARF 缺失[147-149]。p53 作为抑癌基因能够激活细胞内许多通路如 DNA 损伤修复、细胞周期停滞、细胞凋亡等，防止细胞发生癌变[107]。p53通路的改变在肿瘤中是如此的常见，可能说明它是肿瘤发展中一个必要的步骤。因此p53成为肿瘤基因治疗的理想靶点，目前已有很多针对p53进行治疗的研究。在促进 DNA 损伤的条件下如顺铂[223, 224]、紫外线或电离辐射[225]、DNA 修复受抑制[226, 227]，外源性的 p53 能够发挥出更加强大的促进细胞凋亡的作用。临床上，已经将这种现象转化为 p53 腺病毒和 DNA 损伤诱导如顺铂或放射联合治疗，并且观察到抗肿瘤作用比单一治疗要好。p14ARF 作为新近发现的抑癌因子，能够与 mdm2 结合，而 mdm2 能与 p53 结合使其失去转录因子活性并将其转入胞浆降解；p14ARF 与 mdm2 结合后释放 p53 从而发挥肿瘤抑制作用[196, 198]。同时 p14ARF还能与Foxm1b和myc等转录因子作用，调节其活性从而发挥肿瘤抑制作用[201, 203,204]，因此 p14ARF 也是具有潜力的肿瘤基因治疗靶点，而且与 p53 联合应用应该具有协同作用。本实验采用 AdEasyTM腺病毒载体系统制备携带 p14ARF 基因的重组腺病毒Adp14，并于携带 p53 基因的重组腺病毒 Adp53 联合感染人结肠癌细胞 DLD-1，研究 Adp14 与 Adp53 联合应用对肿瘤细胞的杀伤效果。...........2.2 材料和方法胎牛血清、高糖 DMEM 培养基购于 Gibco 公司；Bio-rad 蛋白定量试剂盒购于 Biorad 公司；抗体 p14ARF、抗体 p53 购于 Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的二抗、抗体β-actin、购于 Proteintech 公司；放线菌酮、MTT 购于 Sigma-Aldrich公司；蛋白裂解液 RIPA 购于上海碧云天生物技术研究所；转染试剂 Lipofectamin2000 购于 Invitrogen 公司；基因β-actin、p14ARF、p53 引物购于上海生工；Ex Taq聚合酶、Sal I 限制酶、Not I 限制酶、T4 DNA 连接酶、DL2000 DNAMarer、λ-HindIII digest Marer购于TaaRa公司；Pac I限制酶、Pme I限制酶购于New EnglandBiolabs 公司；反转录试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒购于 TransGen Biotech公司；蛋白预染 Marer 购于 Fermentas 公司；增强型 ECL 化学发光液购于 Thermo公司；质粒提取试剂盒（去内毒素）购于 OMEGA 公司；塑料孔板、细胞培养瓶购于 Corning 公司；其他试剂购于北京鼎国生物技术有限责任公司；Adluc 和Adp53 购于 Vector Biolabs 公司。.........第 3 章 p14ARF 对帽依赖型翻译起始机制和 IRES 依赖型翻译起始机制的影响.........393.1 前言....393.2 材料和方法......... 393.2.1 主要仪器.......393.2.2 主要试剂与细胞....403.2.3 实验方法.......403.3 实验结果.... 443.4 讨论....533.5 小结....56第 4 章 结 论......57第 3 章 p14ARF 对帽依赖型翻译起始机制和 IRES 依赖型翻译起始机制的影响3.1 前言第一部分结果显示 Adp14 感染 DLD-1 细胞后，内源性 p53 翻译速率下降。研究显示 mdm2 能够被 p53 蛋白激活，并与 p53 蛋白相结合抑制其转录因子的活性，同时还能将 p53 从细胞核转移至胞浆降解，同时有研究显示 mdm2 还能够刺激 p53 蛋白的翻译[187-193]。抑癌因子 p14ARF 能够与 mdm2 结合，使其释放 p53，通过调节 p53 发挥抑癌作用[196-198]。但 p14ARF 在细胞内有很多靶点[185]，也具有多方面的功能。此外，蛋白质翻译起始有两种方式[7, 17]，帽依赖型翻译起始和 IRES型翻译起始，真核生物主要通过帽依赖型翻译起始进行蛋白质翻译，只有特殊情况下如缺氧或应激刺激，少数基因通过 IRES 依赖型翻译起始进行蛋白质翻译。由此，Adp14 感染细胞后 p14ARF 是通过什么方式抑制了 p53 的翻译是值得研究的问题。本实验通过采用 AdEasyTM腺病毒载体系统制备腺病毒 Adp14/p53，研究p14ARF 对外源性 p53 翻译的影响，并通过抑制 mdm2 检测 mdm2 在 p14ARF 抑制 p53 表述方面所起作用。利用 p53/mdm2 双缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（DN-MEFs）检验两种不同蛋白质翻译起始机制下，p14ARF 对外源性 p53 翻译的影响。此外构建人食管癌细胞 OE33-GFP 和 OE33-IRES-GFP 稳转细胞系进一步检测 p14ARF 抑制蛋白质翻译的作用。

........结 论1. 重组腺病毒 Adp14 与 Adp53 联合应用，和重组腺病毒 Adp14/p53 单用，都能增加对肿瘤的抑制作用，但 Adp14/p53 具有更强的抑制肿瘤作用。2. 发现肿瘤抑制因子 p14ARF 具有抑制蛋白质帽依赖型翻译起始机制的功能，IRES 依赖型翻译起始机制能够克服肿瘤抑制因子 p14ARF 的翻译抑制作用，从而保护下游基因的正常表述及功能。综上，通过 IRES 连接的 p14ARF 和 P53 双顺反子表述载体，能够更有效的表述 p53，抑制肿瘤细胞生长。与 p14ARF 联合进行基因治疗的其他基因，置于IRES 元件下游能够保持基因产物的高效翻译，获得更好的治疗效果。这一发现丰富了肿瘤的基因治疗策略。..........参考文献（略）