构建种植体表面Ti

前 言钛及钛合金作为牙科种植材料，其本身所具有的生物活性和机械性能对种植手术的初期稳定性有重要作用，如：钛及钛合金种植体的加工处理、力学性能、设计方式以及与周围组织的附着机制等。研究显示，通过对钛及钛合金种植体表面改性处理，可以显著提高其生物学性能，一方面，增加种植体表面粗糙度可以提高与周围组织接触面积；另一方面，在种植体－骨结合位点形成骨亲和成分，促进两者的结合作用。种植体周围炎是因其特殊的颈部设计和周围组织受到致病菌及其毒力因子的共同作用所产生的感染性疾病，当感染发生时，细菌使上皮与植体分离形成周围袋，进而在植体下部结构定植破坏种植体－骨界面结合，使种植体松动或脱落，这种破坏形式不仅存在于种植早期，在种植体－骨界面形成稳定的骨性结合后也会发生。另外，通过检测分析种植体周围炎的龈下菌群发现，其分布情况与成人牙周炎类似，接近 50%的革兰氏阴性菌（杆菌、梭杆菌等），并能检测出螺旋体等。Ag 粒子因其持久快速的杀菌作用以及无或低毒性（与浓度关于）被应用在各个方面，如饮用水消毒、眼科消毒水、绿脓菌感染等，其抗菌机理包括：1）接触作用：通过库仑引力使 Ag 离子与细菌接触，引起胞内蛋白质凝固、合成酶破损、以及营养传输系统、呼吸系统和电子传输系统受阻等；2）光催化作用：通过产生活性氧离子和羟基自由基等破坏细菌增殖能力等；3）物理抗菌：细菌对其不会造成耐药性，可重复杀菌。GO 因其丰富的含氧官能基团被应用在生物医药领域。研究表明 GO 不仅可以促进体内异位成骨，还具有一定的抗菌性能。为了促进种植体－骨界面结合及避免细菌感染的有效措施便是改性种植体表面，基于以上理论及研究，本实验拟通过正交实验对实验参数进行优化设计，采用电镀法和紫外还原法使 Ti 片表面获得双向改性，利用场发射扫描电子显微镜、接触角测试仪、拉曼光谱仪、X 射线光电子能谱仪、原子力显微镜、纳米压痕仪、纳米划痕仪、电感耦合等离子体质谱仪等仪器对改性前后 Ti 片表面性状进行表征；以革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、变形链球菌）和革兰氏阴性菌（牙龈卟啉单胞菌）为研究对象，通过细菌计数、场发射扫描电子显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜、Image 软件、流式细胞仪、实时定量荧光 PCR 等手段对改性前后 Ti 片表面细菌生物膜形成、生物膜形貌、胞膜完整、凋亡、内部结构、基因表述等情况进行研究，并就其抗菌机理进行探讨；采用人体模拟液浸泡实验和 CC-8 实验对改性前后 Ti 片表面生物矿化和生物活性进行评价。本研究旨在通过表面修饰使 Ti 表面获得抗菌性能，以控制种植体周围组织感染，提高种植成功率。.........文献回顾1．钛种植体表面改性方法钛及钛合金材料表面修饰方法包括化学法、物理法、物理－化学法及生物－化学法。常用的具体方法为以下几种：（1）酸蚀法[1]：常用酸包括硫酸、草酸、硝酸、盐酸以及氢氟酸等，钛及钛合金表面经酸蚀处理后形态规整、无杂质、亲水性较好；（2）碱化处理[2]：最常用的是氢氧化钠溶液，通过碱化处理后，可以在钛及钛合金表面形成类磷灰石结构，且表面存在一层凝胶层（钛酸钠氧化物）和碱性离子；（3）酸蚀法+喷砂/喷砂[3]：喷砂技术是在控制压力和特定时间下，采用高速气流将三氧化二铝或者二氧化钛等材料直接喷射到钛及钛合金表面，而酸蚀过程能使酸性成份作用到钛及钛合金表面的微/纳米孔结构中；（4）表面涂层法：目前临床上广泛使用的涂层材料是羟基磷灰石材料，该材料被等离子火焰通过高温熔化于金属材料表面并牢固结合，从而形成表面涂层结构；（5）溶胶－凝胶法[4]：是将钙磷等成份以适当比例配成胶体溶液，使其涂于钛及钛合金表面，随着溶液的挥发缩聚、热处理及干燥等技术处理后，在材料表面可形成羟磷灰石修饰；（6）激光处理[5]：通过激光处理钛及钛合金表面，可以使其表面获得粗化结构，促进材料表面生物矿化能力和骨结合作用，骨组织以整合方式或生物化学键向次级或者更小的界面生长结合；（7）微弧氧化法[6]：配制一定比例的电解质溶液，把钛及钛合金浸没于该溶液中，通过施加正电压，在材料表面可形成开放的、立体的多孔结构，这种多孔结构可以使金属基板与其表面的磷灰石层之间形成较强的结合力；（8）阳极氧化法[7]：在电解质溶液中，通过电压使钛及钛合金表面被氧化，钛元素失去电子后，变成了2价的钛离子，同时会有氢气产生，钛材料表面被氧化后会形成一层致密的氧化膜（二氧化钛），该氧化膜可以阻碍其下的钛原子继续被氧化，因而可以提高钛及钛合金表面结构的现实与性能。微弧氧化法和阳极氧化法属于电镀法范畴。..........2. 种植体周感染目前，牙列缺损或缺失的重要修复方法之一是牙科种植技术，随临床调查研究，其成功率已达 90%～95%[8－11]。据不完全统计，每年大约有 200 万颗种植钉被植入患者口腔内。随着种植设备及技术的不断改善、人们生活质量的不断提高、人口老龄化的加剧，种植钉年植入量将呈上升趋势[12]。尽管种植体成功率达到 90%以上，但临床上仍存在 5%～11%的失败率[13－15]，分析其原因可分为生物力学失败和生物学失败。生物力学失败：由于机械、磨牙或骨折等损伤使种植体功能负荷过重而导致。生物学失败：手术创口愈合不良，细菌定植而引发的种植体周围组织感染[12，16－21]。导致生物学失败的主要原因可分为两种情况，即早期种植体周感染和晚期种植体周感染[22－24]。早期种植体周感染：发生在种植体－骨结合之前，手术创伤、术中及术后，细菌侵入并繁殖是早期种植体周感染的主要因素[13，16，19，25，26]；晚期种植体周感染：又称为菌斑型种植体周围炎，与菌斑积聚所引起的免疫反应关于，发生时间一般是种植体植入 1 年后[19，27－29]。导致种植失败的主要原因之一是种植体周感染，若处理不当，将发生一系列问题，如：种植体松动、种植体移除、二次手术清创、长期抗生素治疗、败血症等[30－35]。因此，种植体周感染决定了种植成功率，并严重危害患者口腔健康。骨结合（Osseointegration）：正常的改建骨和种植体直接接触，无光镜下可见软组织长入，并能使种植体负荷持续传导并分散于骨组织中。;牙种植治疗目标是使种植体稳定地锚着于上或下颌骨内[36－39]。骨结合，从组织学角度分析，是种植体材料表面沉积有骨组织，且没有纤维成份长入。如果口腔内细菌侵入种植体周软组织，可能会妨碍或逆转骨与种植体材料表面组合进程，并引起炎症反应，若未得到有效控制，细菌因素引起的炎症反应将会影响种植体－骨界面结合，最终出现种植体周围骨丧失及松动，即种植失败。种植体植入后，其周围的黏膜良好封闭作用能有效阻止种植体周围软组织免受口腔内细菌微生物侵犯。因此，种植基台周围良好的黏膜封闭作用，是影响骨结合的重要因素[36, 40, 41]。种植体周围病是宿主种植体周软硬组织病理变化的统称，它包括种植体周黏膜炎和种植体周炎（peri-implantitis）。种植体周黏膜炎：炎症仅累及种植体周软组织的可逆性的炎性反应。种植体周炎：炎症除侵犯软组织外，还累及硬组织，主要临床表现为深袋形成、骨组织丧失以及 X 线片示种植体周围低密度暗影[12]，是种植体周软硬组织病理现实的统称，也称为慢性进展性边缘炎症，............实验三 种植体表面 Ti-GO-Ag 多相复合材料对牙龈卟啉单胞菌的实验研究......961 材料........962 方法........973 结果........994 讨论..........1045 结论..........105第三部分 种植体表面 Ti-GO-Ag 多相复合材料的部分生物活性评价......106实验一 种植体表面 Ti-GO-Ag 多相复合材料的矿化及细胞活力评价......1061 材料..........1062 方法..........1073 结果..........1084 讨论..........1125 结论..........113第三部分 种植体表面 Ti-GO-Ag 多相复合材料的部分生物活性评价实验一 种植体表面 Ti-GO-Ag 多相复合材料的矿化及细胞活力评价钛及钛合金种植体表面改性后其生物安全性评价是进行后续生物学性能研究的前提条件，而本实验中对 Ti 片表面改性的材料是 GO 和 Ag，这两种物质会因条件变化而存在细胞毒性[184, 223]，虽然本实验前期研究结果表明，四种不同浓度（20μg/ml、50 g/ml、80 μg/ml、100 μg/ml）的 GO 改性 Ti 片表面后对 Sa 没有抗菌性能，反而促进其黏附和生长，但 GO 与 Ag 联合以后，其性能可能会发生变化，因此，本实验分别采用人体模拟液浸泡法和 CC-8 法评价多相复合材料表面的矿化能力和原代骨髓间充质干细胞活力状况。试样正面朝上置于 24 孔板内，将骨髓间充质干细胞（MSCs）接种于含 Ti 片的孔内，细胞密度为 5×104/孔，37℃培养 48 小时后，用 PBS 液轻柔漂洗试样，放于新的 24 孔板中，并加入 30 μlCC-8 液和 300 μlα-MEM，断续培养 2 小时，在 450 nm波长下用分光光度计读取数值，每个样品设三个平行实验。

.........小 结本研究以纯 Ti 片为基底，以 GO 和硝酸银为改性材料，通过电镀法紫外还原法制备 Ti-GO-Ag 多相复合材料，利用正交实验设计对制备工艺参数（电压、时间、浓度）进行优化，确定工艺参数为：电压 20 V，时间 5 min，浓度 20 μg/ml，50 μg/ml，80 μg/ml，100 μg/ml，并通过表征手段对其表面形貌、成份、含量、性状等材料学性能进行研究；采用电感耦合等离子体质谱仪对 Ti 片表面 Ag 离子释放规律进行探讨；研究了钛片表面涂层对口腔常见致病的抗菌效果及抗菌机理；评价了 Ti 片表面涂层的生物矿化和生物活性能力，通过以上研究，本课题得出以下主要结论：1. 通过正交实验设计可以优化实验参数，电压为 20 V，时间为 5 min，浓度选择 20 μg/ml、50 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml；2. 采用电镀法和紫外还原法，以优化后实验参数为反应条件，可以在纯 Ti 表面构建金属相－膜相－颗粒相三相复合涂层；3. 利用表征手段对钛片表面涂层形貌、轮廓、粗糙度、含量、性价、亲水性、弹性模量、维氏硬度、摩擦力以及 Ag 粒子释放情况等进行分析，与纯 Ti 组相比均有一定改变，且与 GO 浓度和 Ag 粒子含量有很大关系；4. 改性后 Ti 片表面涂层对口腔常见致病菌均有一定的抗菌效果，且对革兰氏阴性菌的作用优于革兰氏阳性菌，其抗菌机制是 Ag 粒子攻击细菌胞膜，聚焦胞内，引起氧化应激，导致胞膜穿孔破裂，胞质外泄，相关致病基因表述水平下调；5. 使用人体模拟液浸泡实验和 CC-8 实验对改性前后 Ti 片表面生物学性能进行研究，结果显示生物矿化能力较优的是对照组、G20 组和 G80 组，四组实验组表面涂层细胞活性较对照组低，且与 GO 浓度及银含量关于，在后续实验中将对 GO浓度和银含量进一步细化研究，以期获得具有较优抗菌和生物活性的双相种植体表面改性材料。..........参考文献（略）