生物活性蛋白导向简易构建新型高效安全的纳米探针用于肿瘤的诊疗

前言研究现状、成果目前，肿瘤已经成为全球范围内的重大公共健康问题。据统计，美国 2021年预计会有 168.8 万新发肿瘤病例，并且预计每天大约会有 1650 名患者死于肿瘤[1]。而拥有庞大人口基数的中国，2021 年大约有 429.2 万新发肿瘤病例和 281.4万死亡病例，相当于每天会有超过 1.2 万人新患肿瘤并且有超过 7500 人死于肿瘤[2]。随着医疗早期诊断及治疗水平的提高和肿瘤筛查范围的扩大，肿瘤的死亡率从 2006 年开始就有显著下降的趋势，但是肿瘤在全世界范围内造成的经济负担以及对患者身心健康的严重威胁注定肿瘤的防治依然是目前以及未来很长一段时间内全球关注的一个医学热点[3]。基于纳米尺度（1-100 nm）构建的纳米材料在过去的二十年里取得了巨大的发展，微观结构带来的丰富功能使其在各个领域大放异彩。纳米医学（nanomedicine）即纳米技术在医学领域的应用[4]。纳米材料应用于生物医学领域具有诸多显著的优势：（1）纳米材料的尺寸接近生物体细胞、细菌、病毒以及蛋白等生物分子，可直接参与机体生理代谢过程；（2）纳米材料特殊的理化性能（高比表面积、荧光、核磁和光热等），为疾病的诊断与治疗提供了新的技术手段；（3）部分纳米材料特殊的运载能力可以将成像或治疗分子运送至病灶区；（4）可以通过化学手段对纳米材料进行进一步的改造和表面修饰，使其具有更多复合功能；（5）经改性修饰后的纳米材料具有较好的生物相容性，对生物体毒性较小[4-6]。作为纳米医学的主要成分，纳米平台或纳米载体被用来整合治疗试剂或成像探针并实现丰富多彩的功能。能用来构建纳米医学探针的无机及有机纳米材料有很多种，以下是一些經典或广泛使用的纳米材料。（1）脂类纳米材料磷脂，作为细胞膜的基本成分，凭借自身极佳的生物安全性以及易获得的特点，很自然地被当作一类可靠的用于搭建纳米医学平台的候选材料。囊泡以及胶束现实的脂类纳米材料被广泛用于药物递送系统，而且人们已经开发出很多成功的纳米医学产品，并将其投入市场和临床试验[7, 8]。脂质体，主要是由自然形成的或人工合成的磷脂以及胆固醇等稳定成分装配而成的几十到几百纳米尺寸不等的囊泡。脂质体可以通过脂类薄膜的再水化以及进一步的物理挤压或超声得到，在用于合成的原始材料里面掺入有功能的试剂，即可得到诊疗一体化的脂质体。对于脂质体来说，其内部充斥着水的部分可以封装亲水物质，其脂类双分子层则可以容纳疏水的小分子。因此，基于脂质体的药物封装构想已经在许多化疗复合药物上成功实现，包括阿霉素（doxorubicin，DOX）、紫杉醇、顺铂、伊立替康、米托蒽醌、BLP25 脂肽、拓扑替康以及长春瑞滨等。脂质体可以很好地将有功能部件和外部环境隔离开，延长体内循环时间并增加在肿瘤处的富集[9-12]。除了脂质体，人们也开发了许多其他脂类药物载体用来递送诊疗试剂，包括纳米乳剂以及固体脂质纳米颗粒。比如，水包油型纳米乳装载了氧化铁纳米颗粒（iron oxide nanoparticles，IONPs）、Cy7 近红外荧光染料以及糖皮质激素泼尼松龙醋酸戊酸酯，可以借助高空间分辨率的磁共振成像（magic resonanceimaging，MRI）以及高灵敏度的荧光成像来观察纳米材料的被吞噬情况以及治疗效果。脂类-药物偶合物也具有明显增强的抗实体肿瘤活性。固体脂质纳米颗粒具有固体脂质核心，能够改善脂质体的物理稳定性，已经被用于递送紫杉醇和 Bcl-2 靶向的 siRNA 杀伤人类肺癌细胞[13, 14]。............（2）聚合物纳米载体聚合物纳米颗粒，包括聚合物-药物偶联体、树枝状大分子、胶束、聚合物囊泡以及微泡等，都已经被用来当作高效的药物递送系统。聚合物-药物偶联体可以提高水力学粒径，有效防止体内代谢清除，延长血液循环时间并提高肿瘤部位药物的富集。到目前为止，已经有十多种聚合物-药物偶联体（大部分是基于 PEG 和 PLGA 体系的）已经被批准进入市场。最近，人们尝试采用刺激响应性的聚合物-药物偶联体用作药物的可控释放。也有一些研究是尝试整合更多治疗及成像元件，从而提高诊疗效果。基于荧光共振能量转移的大分子诊疗前体药物，可以通过腙键的断裂实现对细胞内 DOX 从载体释放的实时监测[17-21]。作为一类高度分支的大分子，具有低密度内部和高密度外表的树枝状大分子在纳米医学诊疗领域具有许多应用价值。与传统高分子聚合物相比，树枝状大分子是一类外形对称、单分散性良好同时具有丰富功能基团的纳米材料。树枝状大分子可以通过非共价封装容纳诊疗试剂，同时，密集的功能基团可以与各种分子进行共价结合。而且，许多功能化的连接能实现活性分子的刺激响应性释放，包括酯键、腙键、氨基甲酸酯、顺式乌头酰基以及二硫键。到目前为止，人们已经开发了若干高效的树枝状大分子用于肿瘤的诊疗一体化，包括聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM）、聚丙烯亚胺（PPI）、聚乙二醇（PEG）、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和三乙醇胺（TEA）。Shi 课题组报道了一种多功能端胺基树枝状大分子包覆金纳米颗粒的平台通过和维生素 E 琥珀酸酯共价结合用于肿瘤的靶向 CT 成像和治疗。维生素 E 琥珀酸酯的共价结合并没有降低其本身的治疗效果，反而极大地提高了材料的水溶性[22-28]。双亲性的嵌段共聚物也是一种构建纳米诊疗试剂的良好元件。嵌段共聚物一般包括亲水部分（如聚乙二醇 PEG 和聚丙烯酸 PAA）及疏水部分（如聚苯乙烯 PS、聚丁烯 PB 和聚乳酸 PLA），两者在水溶液中由于疏水相互作用能引起嵌段共聚物的可控聚集。聚合模块能够聚集成不同结构，包括不同尺寸及形状的胶束、囊泡。由于其化学组成、分子量以及模块长度比都可调节，所以此类共聚物可以根据诊疗需求调节成最佳形貌现实的纳米载体。Liu 等人发展了一种PEG-b-PLGA 囊泡并负载 DOX 和 Gd 复合物用于活体 MR 成像以及杀伤肿瘤细胞[29]。Chen 等人在共聚物的胶束中封装了花菁类染料和化疗药复合物或光敏剂用作荧光成像引导的协同抗肿瘤治疗[30]。而且，胶束的使用能让顺铂抵抗的A549细胞在激光照射下 MRP1 的表述下降，从而实现热-化疗下耐药肿瘤的完全消融。但是，自组装的结构也会有自身的限制和不足。首先，在低于临界胶团浓度的现实下，自组装结构可能会解散，这个可以通过核/壳的化学交联克服。其次，这些纳米颗粒经常会出现药物负载效率低，因为抗癌药和成像探针的共包封需要更多的核心空间。另外，还有可能会出现成像探针和抗癌药物的不匹配释放，从而可能会引起不太理想的诊疗结果。.........一、简易制备的具有内源性生物相容性的透明质酸和转铁蛋白共修饰的 Fe3O4纳米颗粒用于活体肿瘤双靶向磁共振成像恶性肿瘤的早期诊断对于延长患者生存期起到至关重要的作用[186]。为了实现早期诊断，人们发展了诸多基于纳米技术的肿瘤靶向策略，比如通过肿瘤增强渗透与滞留效应（EPR）的被动靶向[62]，单靶标[65, 66, 187, 188]或者双靶标[189-192]配体引导下的肿瘤主动靶向以及基于肿瘤特殊微环境（pH 值，温度和酶）响应的靶向策略[68, 70]。在这些方法中，双靶标修饰设计凭借其对肿瘤细胞协同高靶向能力获得了越来越多的关注。尽管这种双靶标策略的优越性已经被人们广泛认可，但是前人在构建双靶标探针的过程中依然存在着合成步骤繁琐和反应条件苛刻等问题，这些都可能会影响靶标分子的活性。因此，亟需采用一种合成步骤简易、反应条件温和的方法来构建一种新型双靶向纳米平台。生物相容性作为各种纳米探针能否进入临床应用的一个不可避免的挑战，阻碍了很多具有出色靶向诊断功能探针的进一步临床转化[193-196]。即使某些纳米材料在活体及体外实验中展现了良好的物理化学特性、高效的靶向能力以及出色的诊疗效果，其代谢途径和系统毒性依然受到人们的质疑[197-201]。因此，仅有四氧化三铁（Fe3O4）等很少的纳米探针被真正应用于临床诊断，但是这些探针的肿瘤靶向能力也是差强人意。Fe3O4纳米颗粒，作为一种核磁共振成像中的T2加权成像的对比剂[88-90]，在代谢及生物毒性方面已经被人们研究得比较透彻。这种纳米颗粒进入体内之后会被细胞吞噬，然后在溶酶体中被代谢为游离铁离子可用于人体造血等其他用途[202-205]。因此，基于 Fe3O4纳米颗粒，采用一种相对简易的方法构建一种具有出色肿瘤靶向能力以及极佳的生物安全性的双靶向纳米平台是十分有价值的。..........1.1 材料和方法Fe3O4@HA 纳米颗粒是通过一种简易的共沉淀方法制得的。简易地说，称取 0.5 g FeCl3·6H2O 和 0.184 g FeCl2·4H2O 溶解于 25 mL 的高纯水中，先于氩气环境中机械搅拌 15 分钟；然后取 7.5 mL 的氨水快速加入上述溶液，溶液的颜色立即由黄色变成了黑色，提示已经形成了 Fe3O4纳米颗粒；随后，快速加入 5mL HA 水溶液（40 mg/mL），整个体系在室温环境下继续机械搅拌反应 30 分钟。最后用外磁场分离得到纳米材料，并用高纯水洗涤三次。同样，将 HA 换成PEG-2COOH 并重复上述合成过程即可得到 Fe3O4@PEG 纳米颗粒。将提纯之后的 Fe3O4@HA 和 Fe3O4@PEG 纳米颗粒分别分散于 20 mL 高纯水中并置于 4 °C保存。取 50 mg Fe3O4@HA 纳米颗粒溶于 20 mL PBS（pH 7.0）中并置于一个圆底烧瓶中，然后加入 7.2 mg EDC 和 4.3 mg NHS，机械搅拌反应 1 h。接着将含有5 mg Tf 的 1 mL PBS（pH 7.0）加入到上述溶液，继续反应 4 h。反应终止后，借助外磁场，将所得 Fe3O4@HA@Tf 纳米颗粒用高纯水洗 3 遍以除去过量反应物。在清洗过程中的上清液全部被收集，并用高纯水定容至 30 mL 用于 Tf 的定量分析。最后将提纯的产物再分散在高纯水中，避光 4 °C 保存。..........三、抗原引导下合成的具有超高抗原负载率的 OVA-ICG 纳米疫苗............533.1 材料与方法 ..........553.2 结果与讨论 ..........593.2.1 OVA-ICG 纳米疫苗的合成及表征............593.2.2 OVA-ICG 纳米疫苗的细胞毒性以及肿瘤细胞光热杀伤效果........613.2.3 OVA-ICG 纳米疫苗的免疫激活能力........653.2.4 OVA-ICG 纳米疫苗用于肿瘤活体光热-免疫联合治疗.........663.2.5 OVA-ICG 纳米疫苗用于肿瘤预防............673.2.6 OVA-ICG 纳米疫苗的活体免疫示踪........683.3 小结 ............72三、抗原引导下合成的具有超高抗原负载率的 OVA-ICG纳米疫苗用于树突状细胞激活和示踪以及成像引导下的光热-免疫联合抗肿瘤治疗在过去的几十年中，由于早期筛查以及不断进步的医疗技术，如手术、化疗以及放疗，肿瘤患者的五年生存率明显增加，患者预后取得了较大的改善[260]。但是由于肿瘤的异质性，以目前的技术手段很难根治肿瘤，而且也没有很好的特效药[261, 262]。在后基因组时代，基于靶向及联合治疗的肿瘤患者个体化疗法正逐渐革新目前的肿瘤治疗[263]。其中，通过激活自身免疫系统去攻击、杀灭肿瘤的免疫疗法目前受到了极大关注，甚至有人认为免疫治疗是最有可能攻克肿瘤的疗法[158-161]。在各种免疫治疗的方法中，肿瘤纳米疫苗不仅可以引起体内特异性的抗肿瘤免疫，还具有长期免疫记忆功能，因此受到了人们的极大关注[264-268]。传统合成纳米疫苗的方法主要是利用各种不同的载体负载抗原、佐剂以及细胞因子并控制其释放，常用载体包括脂质体[269]、高分子聚合物[270]、无机纳米颗粒[271]、生物高分子种植[272, 273]以及水凝胶[274]等。尽管取得了不错的效果，但是有限的抗原负载效率、繁琐的制备过程、不确定的成分与结构以及可能存在的系统毒性等问题严重阻碍了传统纳米疫苗的推广[159, 275, 276]。理想现实下的纳米疫苗应该具高抗原负载率、安全、高效、廉价以及可扩展等特性[122-126]。因此，发展新的方法来构建最接近理想现实的纳米疫苗具有重要意义，同时也十分具有挑战性。基于疫苗的免疫治疗能够尽可能清除残存的肿瘤组织，并可通过激活体内的免疫记忆功能维持长期抗肿瘤免疫，但是却难以直接杀灭原发肿瘤。所以肿瘤疫苗疗法需与其他治疗策略互补，方能达到协同杀灭肿瘤的作用。光热治疗是一种采用光吸收剂将光能转化为热能并杀伤肿瘤的一种非侵入性治疗手段，因而可以在很短时间内实现对原发肿瘤的强力消融并清除大部分肿瘤实质[112,277]。所以光热治疗联合肿瘤疫苗能够优势互补，既能最大程度的消除原发肿瘤病灶，又能清除残存的肿瘤组织，从而达到协同治疗的目的。

........结论发展更加简易、高效、安全以及高临床转化前景的纳米探针用于以恶性肿瘤为代表的临床疾病的诊疗是当下纳米技术在生物医学领域追求的热点主题之一。因此，在本次研究中我们充分利用不同生物活性蛋白分子的特点及功能，提出了三种简易构建具有优越性能的肿瘤靶向诊疗纳米探针的策略，并通过具体设计实例验证了不同策略的可行性。1、整合双靶标修饰策略和选择内源性元素及生物分子可以构建安全、高效的肿瘤靶向成像诊断探针。使用纳米探针来诊断临床恶性肿瘤需要满足苛刻的诊断敏感性及生物安全性方面的要求。整合双靶标修饰和选择内源性元素及生物分子作为原始材料的策略在构建高灵敏度、生物友好的纳米平台方面展现了巨大的潜能。为了实现上述设计策略，我们构建了一种基于内源性透明质酸分子和转铁蛋白分子共修饰的具有良好生物相容性的双靶向 Fe3O4纳米颗粒用于肿瘤的磁共振成像。体内及体外实验证明该纳米探针具有良好的生物相容性和出色的肿瘤靶向能力并被成功地应用于活体肿瘤的靶向磁共振成像，具备应用于临床肿瘤诊断的巨大潜力。2、模拟药物-底物相互作用这一仿生策略可以有效构建多功能肿瘤诊疗探针。本研究通过模拟高锰酸钾的消毒过程合成牛血清白蛋白（BSA）包覆的二氧化锰（MnO2）纳米颗粒，所得 BSA-MnO2纳米颗粒拥有小于 10 nm 的粒径、出色的单分散性、良好的水溶性以及高达 7.9 mM-1s-1的 T1弛豫率。一系列毒性评估实验表明该纳米颗粒具有极佳的生物相容性。活体 MR 成像展示了 BSA-MnO2纳米颗粒优越的肾脏和肿瘤靶向 MR 成像能力。基于 BSA-MnO2纳米平台进一步拓展的 BMI 和 BMP 纳米颗粒具有良好的肿瘤光热治疗以及化疗能力。通过模拟高锰酸钾的消毒过程合成的纳米颗粒不仅具有诸多优良的化学特性和良好的肾脏以及肿瘤靶向 MR 成像能力，还能通过负载治疗分子拓展成高效肿瘤靶向的诊疗试剂。另外本研究提出的模拟药物与底物相互作用的合成策略可以推广至其他功能分子，从而构建更多功能丰富的诊疗探针。3、抗原引导下的纳米疫苗合成策略可以有效构建多功能的肿瘤纳米疫苗。本研究中，利用卵清白蛋白（OVA）和吲哚菁绿（ICG）之间的疏水结合自组装合成OVA-ICG 纳米疫苗，该纳米疫苗合成过程极其简易，不添加任何有毒试剂，也不需要苛刻的反应条件。OVA-ICG 纳米疫苗中抗原负载率高达 80.8%，并且具有出色的水溶液稳定性、良好的可重复性以及可冻干保存的特点，便于实现大量生产以及长期存储。该纳米疫苗不仅能在体外有效激活树突状细胞并可以作为高效光热材料杀伤黑色素瘤细胞，而且可以用于活体 DC 近红外荧光示踪以及光热-免疫联合杀伤肿瘤实体及残存瘤块。另外，OVA-ICG 纳米疫苗具有很好的肿瘤预防功能。最重要的是，这种步骤简易、环境友好、不添加有毒试剂的疫苗合成方法为人们构建其他新型多功能抗肿瘤疫苗提供了新的思路，同时此类疫苗的高度可重复性也增加了将来的临床转化和大规模生产的可能性。..........参考文献（略）