核黄素紫外线角膜胶原交联治疗真菌性角膜炎的实验研究
第一章综述
第一节真菌性角膜炎的治疗进展真菌性角膜炎占我国感染性角膜炎的首位，是一种严重的致盲性角膜病。近年来，随着抗生素、激素和免疫抑制剂的广泛应用及农业性植物等致外伤机会的增多，此病在我国有逐年上升的趋势。真菌性角膜炎发病特点是病变早期眼部刺激症状较轻，发展较缓慢，患者往往因为病变发展严重影响视功能才到医院就诊，此时免疫反应和病灶向角膜深层扩散，极易引起角膜穿孔或眼内炎发生。根据临床表现，以及实验室检查找到真菌和菌丝可以确诊真菌性角膜炎。虽然抗真菌药物种类多，但是对于治疗真菌性角膜炎有特异性疗效的治疗药物临床可选择的不多，存在眼部渗透性差、疗效不确切等缺点。药物不能控制的真菌性角膜炎的最终手段是角膜移植手术，但是因供体不足，限制其临床应用。因此真菌性角膜炎的治疗一直是眼科界的难题之一。随着科技发展，现阶段抗真菌药物的种类和给药方式、真菌性角膜炎手术治疗不断创新与改革，以及其他新型疗法的出现如核黄素紫外线角膜交联法，都给真菌性角膜炎的治疗带来曙光。本文就近年来真菌性角膜炎的治疗进展作一综述。一、药物选择根据药物杀菌作用机制，目前用于抗真菌药物可分为四大类：1，作用于真菌细胞壁，主要影响几丁质、葡聚糖、甘露聚糖和甘露蛋白质复合物的抗真菌药物，如抑制真菌细胞壁主要成分葡聚糖合成的棘白菌素类和抑制几丁质合成的日光霉素；2,直接作用于真菌细胞膜脂质结构和功能的抗真菌药物，如多稀类；3，影响真菌细胞膜麦角固醇的生物合成的抗真菌药物，如哩类、稀丙胺类；4,干扰真菌核酸合成的抗真菌药物，如氟胞啼淀。1.影响真菌细胞壁合成的抗真菌药物代表性药物有棘白菌素类的卡泊芬净（caspofungin)、米卡芬净(micafungin)和阿尼芬净（anidulafungin)。其中，卡泊芬净是新型抗真菌化合物棘白菌素类中第一个用于临床的药物，2001年2月美国食品药品管理局（Food and Drug Administration, FDA)和欧洲批准用于两性霉素B治疗无效或不能耐受两性霉素B的侵袭性曲霉菌病患者。卡泊芬净口服吸收差，可以通过点眼、静脉注射、玻璃体注射途径给药。治疗真菌性角膜炎时应去除角膜上皮后采取频繁点眼的方式。研究表明去除兔眼角膜上皮，每30min点眼1次，持续6h。1、2、5 h房水中药物质量浓度分别为（2111±1109)、（4194±1180)、（3145土2111)mg/L,超过绝大部分真菌的MIC90。卡泊芬净局部应用安全，未见眼表组织毒性。2.直接作用于真菌细胞壁麦角固醇的抗真菌药物代表性药物为多烯类的两性霉素B (AmB)和那他霉素。麦角固醇是真菌细胞膜的主要固醇，参与多项细胞功能，多稀类药物与麦角固醇结合，细胞膜脂质双层去极化，出现微孔，导致细胞膜通透性改变而发挥杀菌作用。虽然多稀类药物具有广谱抗真菌作用，于人体全身使用时表现出严重肾毒性，限制其临床应用。那他霉素为美国FDA唯一批准的抗真菌滴眼液，常用制剂为5%的混悬液。抗丝状真菌的效果较好,尤其是镰刀菌和曲霉菌。一项对照实验表明[4]，对镰刀菌角膜炎的治疗中，使用5%那他霉素滴眼液的患者治愈率高于使用1%伊曲康唑滴眼液的患者，但二者的最佳矫正视力和症痕愈合方面没有显著性差异。另外，研究证实伊曲康唑治疗镰刀菌属角膜炎的角膜穿孔率高于那他霉素者[5]。那他霉素目前仅限于局部滴眼，对镰刀菌属角膜炎效果明确，但对念珠菌等其他真菌性角膜感染疗效逊于AmB，且治疗镰刀菌属角膜深层感染时需联合使用酮康唑或伊曲康唑结膜下注射或全身用药[6]。AmB眼用常用制剂为0.15%，是治疗念珠菌性角膜炎的首选药物，其药物毒性及副作用限制了滴眼液浓度及临床应用。3. 直接作用于真苗细胞膜脂质结构和功能的抗真苗药物代表性药物有唑类抗真菌药物的氟康挫、伊曲康唑和咪唾类的酮康哇，新型的三唑类药物还有伏立康挫。氟康唑和酮康唑可以口服、局部滴眼和静脉给药。报道显示，氟康哩滴眼液成功治疗因使用那他霉素或咪康啤滴眼无效的念珠菌角膜炎[7]。氟康唑具有低毒性、良好的眼部渗透性和对念珠菌深部感染有效的特点，其缺点为仅限于对浅层角膜的丝状真菌感染有效。伏立康挫作为一种新型的挫类抗真菌药物，其抗菌谱广，FDA批准其用于严重的曲霉菌、足放线菌和镰刀菌感染的治疗。文献综述显示伏立康唾对镰刀菌属和念珠菌属等大部分的眼部真菌性感染有效[8]。一项研究表明[9]，伏立康哩滴眼或角膜基质注射均可治愈真菌性角膜炎。伏立康哩有望替代那他霉素成为主要的眼局部抗真菌药物，但目前尚无商品化的伏立康唾滴眼液。
第二章离体实验研究
致病真菌种类繁多，临床表现复杂，给治疗带来很大困难。核黄素紫外线角膜交联是一种提高角膜机械强度和生物学稳定性的新方法。2003年，Wollensa等首次报道了应用核黄素角膜交联成功治疗严重圆锥角膜。核黄素即维生素B2，是一种人体必需的维生素，在角膜交联的过程中，受一定波长（365nm或370nm)紫外光照射，核黄素吸收能量转变为激发态，产生氧自由基和单态氧，使角膜胶原纤维之间产生共价键结合发生交联，从而增加了角膜的硬度；同时核黄素光化学作用导致微生物的核酸断裂并阻止核酸复制，因此具有灭活微生物的效应。近几年核黄素紫外线角膜交联不断发展，在多种角膜疾病如角膜扩张，边缘性角膜变性和感染性角膜炎等方面得到应用。但是，有研究表明-B纸片扩散试验中核黄素紫外线角膜交联疗法对白色念珠菌、烟曲霉菌和戒病镰刀菌无抗菌作用。基于上述研究，笔者推测角膜交联疗法抗真菌活性可能受环境介质和真菌浓度影响。通过研究角膜交联疗法对倍比稀释浓度的菌悬液中前病镰刀菌和白色念珠菌的抗菌性，探索其在真菌感染中作用，为治疗真菌性角膜炎寻求新途径。
1材料及设备1.1实验菌株白色念珠菌菌株由山东赛克赛思药业有限公司生化实验室提供。痴病镰刀菌菌株（No.3.4489)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。1.2培养基Sabouraud葡萄糖琼脂培养基（北京三药科技有限公司）。1.3主要试剂0.3%核黄素憐酸钠溶液（江西制药有限公司）；憐酸盐缓冲液（PBS，山东赛克赛思药业有限公司）。1.4主要仪器WGZ-2-X麦氏独度仪（上海艾孜生物科技有阪公司）；48孔细胞培养板（美国Costar Corning公司）；角膜交联紫外线（波长365 nm)照射仪UV-1000X (瑞士 IROC公司）；数显恒温摇床、生化培养箱、洁净工作台、微量取样器、移液管、试管等均为国产。
4讨论真菌，是一种真核生物。与细菌、病毒等微生物不同，真菌细胞具有含甲壳素成分的细胞壁，细胞壁厚。角膜炎常见的致病真菌有丝状菌和酵母菌。丝状菌产生特征性的细长分支菌丝,在培养基上形成羽毛或棉絮状菌落。酵母菌主要为念珠菌属，以芽生方式繁殖,在低氧环境或组织中生成具有侵袭能力的假菌丝,在培养基上形成乳油状不透明的菌落。引起角膜感染的主要真菌菌种在不同地区差别较大。发展中国家及气候温暖或炎热地区主要是镰刀菌和曲霉菌，发达国家及气候较寒冷地区(如美国北部和英国）的最常见致病菌种为白色念珠菌、曲霉菌和镰刀菌。我国广东、河南、河北及山东地区调查显示真菌性角膜炎致病菌种以镰刀菌和曲霉菌为主，大部分地区镰刀菌是首位致病菌，占28%?65%;其次为曲霉菌11 %-49%；前病镰刀菌是镰刀菌属中的主要致病菌种。近10年来，真菌性角膜炎的发病率在我国明显升高，主要与广泛应用广谱抗菌素及皮质类固醇激素，或长期佩戴角膜接触镜和应用免疫抑制剂关于[8]。
4.1真菌性角膜炎的发病机制和眼局部抗真藺药物正常人结膜囊真菌培养阳性率为2% 25%，正常情况下不致病，但一定条件下如外伤、长期应用抗生素而致菌群失调或应用激素、免疫抑制剂而免疫力低下时，外源性或内源性真菌在眼部繁殖即可致病。Scliwab[9]认为丝状真菌性角膜炎多发于健康人，其易感因素为外伤，特别是植物性外伤，局部应用激素能提高发病的可能性，但不是必须条件；白色念珠菌性角膜炎的主要易感因素是长期的角膜上皮溃病。穿透性角膜移植术、佩戴治疗性软性接触镜、局部应用激素促进了真菌的繁殖。由于对角膜真菌感染的基础研究较少，目前尚不清楚真菌性角膜炎的发病机制。研究表明，烟曲霉菌，白色念珠菌可以与多种细胞外基质如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型胶原、纤维蛋白原和明胶结合，其结合能力的强弱与致病力成正比。体外研究证实痴病镰刀菌、黄曲霉菌在含胶原的培养基中，可产生能降解胶原的蛋白酶如丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，后者在两种真菌感染所致兔角膜炎的角膜组织中也有发现。由此推测，由于角膜上皮受损，基底膜暴露，真菌与角膜组织中的多种细胞外基质发生粘附，粘附后真菌通过产生多种酶类降解破坏角膜组织，从而促使菌丝在角膜中扩散。不同菌株的粘附能力及菌株所分泌的蛋白酶存在差异，导致其在角膜中不同方式的生长。如白色念珠菌粘附能力较强且其所分泌的蛋白酶活性强，在角膜内垂直生长。
中文摘要......................... 1外文摘要........................ 7论文正文........................15第一章综述........................15第二章离体实验研究........................41第三章动物实验研究........................59致谢................................................75攻读学位期间发表的学术论文清单........................77
第三章动物实验研究
在进行眼部真菌感染研究中，最常应用的实验动物是兔。本实验通过对新西兰大白兔的角膜进行真菌感染，成功获得真菌性角膜炎模型；对真菌性角膜炎进行常规剂量的核黄素角膜交联治疗，并与抗真菌药物进行比较，研究了核黄素紫外线角膜交联治疗新西兰大白兔真菌性角膜炎的疗效。本实验已经获得山东大学医学院附属省立医院伦理委员会备案批准。
4.讨论角膜炎常见的致病真菌有丝状菌和酵母菌。丝状菌产生特征性的细长分支菌丝,在培养基上形成羽毛或棉絮状菌落。酵母菌主要为念珠菌属，以芽生方式繁殖，在低氧环境或组织中生成具有侵袭能力的假菌丝,在培养基上形成乳油状不透明的菌落。引起角膜感染的主要真菌菌种在不同地区差别较大。发展中国家及气候温暖或炎热地区主要是镰刀菌和曲霉菌，发达国家及气候较寒冷地区（如美国北部和英国）的最常见致病菌种为白色念珠菌、曲霉菌和镰刀菌。我国广东、河南、河北及山东地区调查显示真菌性角膜炎致病菌种以镰刀菌和曲霉菌为主，大部分地区镰刀菌是首位致病菌，占28%-65%;其次为曲霉菌11%-49%；菊病镰刀菌是镰刀菌属中的主要致病菌种。在角膜上皮受损时，基底膜暴露，真菌与角膜组织中的多种细胞外基质发生粘附，粘附后真菌通过产生多种酶类降解破坏角膜组织，从而促使菌丝在角膜中扩散。不同菌株的粘附能力及菌株所分泌的蛋白酶存在差异，导致其在角膜中不同方式的生长。如白色念珠菌粘附能力较强且其所分泌的蛋白酶活性强，在角膜内垂直生长；而戒病镰刀菌因粘附能力弱、蛋白酶降解力弱，则在角膜板层平行生长[6]。根据作用机制，目前用于抗真菌药物可分为四大类[7]: 1，作用于真菌细胞壁，主要影响几丁质、葡聚糖、甘露聚糖和甘露蛋白质复合物的抗真菌药物，如抑制真菌细胞壁主要成分葡聚糖合成的棘白菌素类和抑制几丁质合成的日光霉素；2，直接作用于真菌细胞膜脂质结构和功能的抗真菌药物，如多稀类；3，影响真菌细胞膜麦角固醇的生物合成的抗真菌药物，如唑类、烯丙胺类；4，干扰真菌核酸合成的抗真菌药物，如5-氟胞啼P定。虽然抗真菌药物种类多，但是对于治疗真菌性角膜炎有特异性疗效的治疗药物临床可选择的不多。目前以那他霉素为代表的多烯类和以酮康唑为代表的哇类是治疗真菌性角膜炎的必选药物，其特征为抗真菌谱广，毒性相对较低，渗透性较强。由于那他霉素和酮康唾均为脂溶性，水溶性差，限制其在角膜中的渗透，对于深层角膜真菌感染治疗作用差。手术治疗方法包括：病变组织刮除，穿透性角膜移植术，部分板层角膜移植术。但是角膜供体不足、术后复发、瘢痕形成以致视力低下常使患者难以获得好的生活质量。眼科工作者近年来对该病的治疗展开了广泛的探索，主要集中在新药物的研发和非穿透性角膜移植术等方面。然而，到目前仍未发现一种高效、低毒、广谱抗真菌的药物。研究发现，在离体条件下，核黄素角膜交联对细菌性角膜炎的常见病原体如金黄色葡萄球菌、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌具有很好的杀灭作用[16]，对真菌和棘阿米巴则无杀灭作用但是Sun等使用常规参数的核黄素紫外线角膜交联照射不同浓度梯度的前病镰刀菌和白色念珠菌菌液后，两组真菌的残留菌数均有一定程度下降，且灭菌率与菌液浓度的对数值呈负相关，作者推测，由于紫外线的穿透力弱，致密的环境介质、真菌菌体的大小以及菌液浓度都可能阻断紫外线，影响其光动力灭活作用。Galperin等通过动物实验证实，角膜交联对家兔的真菌性角膜炎有一定程度的治疗作用。基于上述研究，本实验对新西兰大白兔进行真菌感染，获得真菌性角膜炎的动物模型，分组研究了核黄素角膜交联和抗真菌滴眼液对不同真菌性角膜炎的疗效及角膜愈合情况。实验证实了核黄素角膜交联具有较强的抗真菌疗效，同时经角膜交联治疗后，角膜馈痕愈合的纤维增殖较少，基质层胶原纤维的排列更紧密。与Ahtar等[25]的研究相类似。可见，核黄素角膜交联治疗感染性角膜炎具有多重效应，光化学作用可以灭活细菌、真菌等病原体，交联过程产生氧自由基和单态氧，使角膜胶原纤维之间产生共价键结合，胶原纤维排列紧密，增加了角膜的硬度，更有利于角膜溃疬的愈合。尚有研究表明[26]，角膜交联增加角膜抗蛋白水解酶的能力，可能也参与了溃荡愈合。
.........参考文献（略）