CCR7及AQP1与舌癌转移相关的初步研究
文献综述一CCR7/CCL21在胖瘤转移中的研宄进展
1.CCR7/CCL21的发现命名及分子结构
人血小板因子储存于血小板颗粒中，具有促凝血和抗血管形成功能。自从1977年Walz等人测定其序列，从而发现第一个趋化因子后，目前己有多达40种的人类趋化因子被鉴别出来。趋化因子是一组介导白细胞聚集和激活的小分子分泌蛋白（8-14Da)。其通过与G蛋白结合受体的绑定介导其功能，刺激细胞内信号通路，不仅在炎症细胞的指向性外渗中起到了关键作用，还诱导细胞的增殖和迁移，并参与血管形成。趋化因子可以通过结构中保守半胱氧酸的数量及空间分布被分为四个不同的亚型，分别按系统命名法命名为CXC,CC，C，CX3C。其中除了 C亚型趋化因子只有两个保守序列的半胱氨酸外，其余三种亚型则均具有四个此结构，且C亚型的两个分别对应其他亚型的第二和第四个半胱氨酸。CC趋化因子的一个小亚群含有六个半胱氨酸。在CC亚型的趋化因子中，前两个半胱氨酸是相联的。而在CXC和CX3C亚型中，其第一和第二个半胱氨酸之间夹有1个或3个氣基酸。趋化因子受体是趋化因子蛋白超家族的成员，其可以结合一个或者多个化学趋化因子，并进行信号传导。趋化因子受体与特异性趋化因子配体的相互作用，从而造成细胞内游离韩离子的流失（韩信号通道)。这使细胞产生一系列应激反应，包括启动被称为化学趋向性;的进程，即将细胞输送至机体内特定位置。目前为止，人类趋化因子受体家族成员己增加至19个。基于他们各自特定的趋化因子偏好，这些蛋白又被分为XCR1、CX3CR1、CCR1-11及CXCR1-5多个亚型。
2.CCR7/CCL21的生物学作用
过去十年中，大量的趋化因子及其受体被鉴定出来。趋化因子被认为对淋巴组织的发展具有调控作用，并作为调节因子在白细胞的成熟稳重、交通和归巢中行使其功能[8]，并可能在白细胞的感染和炎症位点的反应中作为引诱剂[1]。一些CC趋化因子被认为促进了炎症细胞的增殖，而CCR7正是被证实具有此功能性的趋化因子受体之一。CCR7的两个配体，CCL19和CCL21，则参与了激活的T细胞和表述CCR7的自然杀伤细胞的募集与增殖[9 在表述CCR7的人肾小球内皮细胞中，Ca21的预刺激减少了 Fas诱导的凋亡，从而有效阻止了半腕氨酸天冬氨酸蛋白激酶3 (caspase-3)的激活[ii]。CCR7由G蛋白受体家族基因编码。这个受体是作为由Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)基因诱导表述，并被认为作为一种媒介参与了 EBV与B淋巴细胞的相互作用。此受体在多种淋巴组织以及激活的B和T淋巴细胞中均有表述。它被证实对记忆T细胞在次级淋巴器官如淋巴结和剌激树突状细胞的成熟稳重的定向迁移中起到调节作用。CCR7是一种主要表述于未成熟稳重的B细胞、T细胞和中央记忆细胞以及半成熟稳重和成熟稳重树突状细胞（dendritic cells，DCs)中的G蛋白结合受体在淋巴结的高内皮静脉（high endothelial vessels, HEVs)中则发现持续表述的CCR7配体，CCL19和CCL21。而成纤维细胞网状细胞和滤泡状树突状细胞形成则引导T细胞在淋巴结管状结构中的迁移因此，CCR7是淋巴结内对促进优化启动DOT细胞抗原特异性反应起着关键性调控作用的趋化因子受体，除此以外，CCR7信号传导在次级淋巴器官的形成和维持中，还参与了许多免疫进程，如T细胞和调节T细胞（regulatory T-cell,Treg)的自稳调节，中枢和外周耐受及胸腺细胞的分化等。
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第一部分CCR7表述与舌癌转移及预后的关系研究
舌癌是口腔鳞状细胞癌（SCC )中最具代表性且侵袭性较高的一种恶性肿瘤，发病率在世界范围内位居第六位[159]。舌癌展现出了对颈淋巴结的高转移潜能，然而其远处转移率却很低。有研宄报道，在初期诊断阶段，40%的舌癌患者具有颈部转移，而40%的2期病变显示具有隐匿转移。在具有颈部转移的患者中，治愈率降低了 50%。这使得颈部淋巴结转移成为影响口腔癌预后的一个重要因素。因此，为了改善舌癌患者的生存率，找出更优化的疗法，对器官特异性转移相关的目标基因的鉴别研究成为一个必不可少的课题。淋巴结及其他免疫细胞持续分泌表述趋化因子CCL19/21，而它们通过和C-C趋化因子受体（CCR7)的相互作用，在淋巴细胞归巢过程中起到了关键作用。因此，最近的归巢;理论提出，CCR7与CCL21的相互作用，可能利用与白细胞募集类似的机制，引导了侵袭性癌症细胞在特异性继发器官中的固定CCR7的表述与淋巴结转移的相关性在恶性黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌和胃癌的相关研究中均有报道。但就目前所知，在舌鳞状细胞癌中，尚未关于于CCR7作用机制的特定报道。Tsuzui等人对头颈部鳞状细胞癌中CCR7的一些研究则局限于临床病理和免疫组化学方面
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材料和方法
(一)主要试剂
1.鼠抗人CCR7抗体（美国RD)
2.羊抗人CCL21抗体（美国RD)
3.羊抗人VEGF-C抗体（美国RD)
4.鼠抗人D2-40抗体（北京中杉）
5.人重组Ca21因子（美国MD)
6.山羊抗鼠二抗（美国Pierce)
7.兔抗羊二抗（美国Sigma)
8.浓缩型DAB试剂盒（来源于中杉金桥生物公司，北京）
9.PBS solution (来源于迈新生物公司，福州）
10.枸機酸盐抗原修复液（来源于迈新生物公司，福州）
11.无水乙醇（上海振兴化学试剂有限公司）
12.二甲苯（来源于国药集团，上海）
第一部分 CCR7与舌癌转移及预后的关系研究........20
参考文献一........54
文献综述二 AQP在肿瘤转移中的研究进展........69
第二部分 AQP1表述在舌癌转移及血管生成中的作用........83
参考文献........100
讨论
组织缺氧是指组织氧张力从正常水平减少的现实，经常发生于在急性和慢性血管疾病、肺部疾病以及癌症中[282]。它被认为是实体肿瘤最重要的特性之一，在各种细胞和生理活动中发挥着关键作用，包括细胞增殖、免疫监视作用、新陈代谢、生存、血管生成、以及肿瘤侵袭和转移。而这些在组织缺氧下的应激反应至少部分是由激活的低氧诱导因子（HIFs)所协调的。mFl是调节哺乳动物细胞在缺氧现实反应的关键之一，并且在肿瘤细胞适应低氧微环境中起到了重要作用。如果不形成新的血管，则肿瘤无法生长至超过直径l-2mm的大小。因此，血管形成是人类癌症的重要特征。而组织缺氧则是肿瘤生长及肿瘤血管形成的关键调节因素。大量肿瘤血管生成因子（例如VEGF)在组织缺氧时被诱导表述的现象则证明了这点。缺氧是诱导肿瘤血管生成的生理学信号，HIF-la的表述上调正是缺氧所诱导激活的信号之一研究认为，HIF-l是细胞缺氧的内源性标志物，在缺氧条件下，mF-la作为主要转录因子参与诱导的基因对肿瘤生存和演化起到了关键作用，而HIF-1激活的转录通道是在包括癌症在内的许多疾病的病理特征。不成熟稳重的血管网络和血流量的减少，造成了肿瘤内的微环境的缺氧，并直接影响细胞内氧张力。
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结论
血管生成是一个连同内皮细胞激活、血管基底膜降解、内皮细胞增殖、分化、迁徙和生长等在内的复杂的物理生理学过程,其中内皮细胞的迁徙是血管形成的初期条件。去AQP1化的大鼠组织中可以观察到，由于AQP1依赖性水转运被切断，导致肿瘤血管内皮细胞迁徙的显著障碍[^9]。去除AQP1减少了内皮细胞的迁徙，但并没有影响其增殖或者粘附。结合我们此次研宄的结果，很可能是由于AQP1促进了内皮细胞迁徙，从而促成了舌癌肿瘤血管的形成。在此次研究表明，AQP1的表述直接关系到HIFla的表述，并且与MVD、肿瘤大小和颈淋巴结转移均有相关性。肿瘤细胞缺乏正常屏障功能所必须的致密内皮单层，这一变异通常伴随无功能或者少功能的淋巴管及可收缩的间质成分的泄露，从而引起组织间隙渗透压的增高。而组织间高间隙渗透压导致的缺氧和酸化则进一步反馈在肿瘤细胞的快速生长和低血流量上。可能正是肿瘤微血管中AQP1的存在提高了吸水率，从而给肿瘤细胞带来了代谢优势。由此可以假设，增加脉管的渗透性对于内皮细胞参与到血管形成的级联反应中去是十分必要的，它允许血装蛋白的外渗，为迁徙的内皮细胞搭起了临时支架。
参考文献（略）