CD47基因缺陷对恶性肿瘤血管新生的影响及其机制研究
第 1 章 研究背景及目的
1.1 CD47 概述:1.1.1 CD47 结构：CD47，亦称调理素相关蛋白(integrin- associated protein , IAP)[1]是一种广泛表述于多个物种和各个组织之间的大小为50 D左右的跨膜糖蛋白，最初是从人胎盘与整合素αVβ3共纯化中得到的，功能与整合素相关，故此得名[2]。2000年，CD47作为红细胞标识自身的标志被证实，且作为配体与巨噬细胞表面信号调节蛋白α(signal- regulatory proteinα，SIRP-α)结合，产生抑制性信号，抑制巨噬细胞对其的吞噬作用[2]。因此CD47被认为是免疫系统识别‘自我的一个重要因子，并且免疫反应的强度与其表述量成正向关系，例如当一些特定细胞的CD47表述减弱的时候会被自身免疫系统认识并吞噬掉，因此CD47的表述或功能的紊乱都会招致免疫识别及攻击。但是最近的研究表明，CD47在非造血组织上的表述并不是用来标明‘自我，提示CD47的下游通路有多种调节机制存在。另外，最近有报道，CD47 在内皮细胞与T细胞表面的信号调节蛋白γ（Signalregulatory proteinγ，SIRP-γ）相互作用，通过不同的调节机制对内皮细胞与T细胞进行调控，更加表明CD47 的下游调节机制的复杂性及多样性[3]。在免疫系统应答，巨噬细胞吞噬，中性粒细胞趋化激活[3]，中枢神经系统发育，基质细胞支持的造血细胞生成等方面均有至关重要的作用。此外，CD47参与血小板，肿瘤细胞，平滑肌细胞的趋化，扩散过程[1]，抑制IL-12在单核细胞中的释放[4]，并可诱导B细胞,DC,单核细胞的凋亡[5]。CD47基因位于3号染色体上，3q13，分子量在47-55 D之间，与带3蛋白、GPA、GPB、 Rhd相连[6]，编码305个氨基酸组成的跨膜蛋白，其结构包含一个胞外类Ig结构域，5个跨膜片段以及1个羟基端胞内区[7]（图1.1）。其细胞外区存在与配体SIRPα结合位点。其细胞内根据结构不同分成4种异构体，异构体-1，异构体-2存在于内皮、上皮细胞，此外，异构体-2还存在于造血器官。异构体-3，异构体-4存在于神经细胞，肠粘膜细胞及睾丸组织中[8]。
CD47基因转录调控机制尚不明确，已知表述调节因子包括①转录因子核呼吸因子(Nrfl)[9]。②FMS样酪氨酸激酶3的内部串联重复突变（FLT3-ITD）可诱导CD47表述升高，见于急性髓系白血病[10]。③转录因子α-Pal/ NRF-1可正向调控CD47表述。④miR-133a可负向调控CD47的表述[11]。
......
1.2 肿瘤血管新生与肿瘤：血管肿瘤新生是指肿瘤中血管内皮细胞增殖，形成血管芽，并进一步形成新生毛细血管的过程，这个过程中通常需要促血管生成因子的参与。肿瘤血管新生是实体肿瘤生长，侵袭，转移的必要条件[61-62]。肿瘤新生分为二个阶段：血管生成前期和血管生成期，二者区别在于前者无明显新生血管供养，而后者肿瘤中已出现新生血管，新生血管为肿瘤组织输送必需的氧气和营养物质，促进肿瘤的生长和远处转移。前者肿瘤细胞呈线性生长，后者肿瘤细胞呈对数增长，二者的分界线在肿瘤细胞生长至107个细胞，肿瘤达到1-2 mm3时[77]。如无新生血管供养，肿瘤生长将停止，故肿瘤血管的新生对于肿瘤生长有极为重要的作用。肿瘤组织中新生血管来源一般有二个：①肿瘤本身表述的血管内皮细胞生长因子诱导新生血管产生。②宿主正常血管的肿瘤化。肿瘤血管与正常微血管存在异质性，与正常微血管相比，其管壁为一薄层内皮细胞，结构疏松，渗透性大，无基底膜，平滑肌结构，其管壁无神经末梢分布。一般依据其结构和灌注情况，分为3型：①内皮细胞芽，无血流灌注。②小血管芽，无外膜，有血流灌注。③大血管，有外膜，有血管芽[78]。肿瘤血管新生是一个多种因子，多种信号通路共同作用的结果，新生的过程包括：血管生成及抑制因子失衡【血管生成开关打开】→血管内皮基底膜降解→内皮细胞迁移及增殖→血管环形成→新基底膜形成。在这个过程中，血管生成因子和抑制因子二者的平衡对于稳定血管数量及形态十分重要，其失衡在肿瘤血管发生中起到了关键作用[79]，我们形象的称之为血管生成开关（angiogenicswich）[80]。促血管生成因子包括：血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)、血管生成素、环氧化酶-2(COX-2)[81]、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胎盘生长因子(PIGF)、表皮生长因子(EGF)、缺氧诱导因子(HIF)[82]等。VEGF是目前已知最强促血管生长因子，肿瘤组织在肿瘤发展到一定大小后能够分泌VEGF，分泌的VEGF在肿瘤组织中多分布于血管周围，能够诱导肿瘤新生血管生成，抑制其凋亡，发挥其促血管生成的作用。血管生成抑制因子包括：血管生成抑制素[83]、内皮抑素[84]、血小板反应素(TSP)[85]、血小板因子-4(PF4)、转化生长因子b(TGF-b)等。
......
第 2 章 试验器材及试剂
2.1 小鼠品系：C57BL/6 品系小鼠和 CD47 基因敲除小鼠均购自美国 acson lab。小鼠均饲养在吉大一院转化医学研究院 SPF 级小鼠饲养中心，本课题所涉及的转基因小鼠繁育和饲养将在此饲养中心完成。全部动物实验经过吉林大学白求恩医学部动物实验伦理委员会批准。RM1 细胞购自拜力生物科技有限公司（上海）。
......
2.2 主要实验器材器械，装置，仪器名称 型号 生产单位振荡器 SI-0256 型 美国 Scientific Industries离心机 Microfuge 22R 型 美国 Becman，立式蒸汽灭菌器 LDZX-50FBS 型 中国上海申安医疗器械厂凝胶显影系统 GL2200 型 美国 ODAPCR 仪 Arti 美国 Thermo我们对研究中，免疫组化及免疫荧光染色所拍摄照片采用 image pro-plus6.0软件进行分析。所有数据均以均数±标准误表示，以 SPSS15.0 软件包进行统计学处理，多组同比均采用单因素方差分析。两组间比较采用 Students t 检验，P＜0.05 为有统计学差异。将冰冻 RM1 细胞解冻后，分别将其配置成 3×104/ml，6×104/ml，1×105/ml浓度肿瘤细胞，取 8 周龄 WT 健康雄性小鼠 21 只，平均分为 3 组，每组 7 只，标记后分别注射 3×104/ml，6×104/ml，1×105/ml 浓度肿瘤细胞，每隔日测量肿瘤大小，随着注射所用细胞浓度升高，相同注射时间后，其肿瘤大小随肿瘤细胞浓度增加而增加，其肿瘤增长速度随肿瘤细胞浓度增加而增加.处理过程同前， 取 8 周龄左右健康雄性 CD47-/-和 WT 小鼠各 20 只，将WT 小鼠和 CD47-/-小鼠分别随机分成 5 d 处死组，8 d 处死组，11 d 处死组，14d 处死组，每组各 5 只小鼠，分别标记，之后利用 1×105/ml 肿瘤细胞对小鼠进行腹股沟皮下注射，分别于注射后 5,8,11,14 d 以颈椎脱臼法处死各组小鼠，完整取出肿瘤，称重，切开，观察坏死情况，计算肿瘤体积，加以统计分析，实验中发现注射后 5 d，颈椎脱臼法处死小鼠，剥离肿瘤测量并计算肿瘤体积，其结果所示肿瘤体积 CD47-/-组和 WT 组无明显差异,至注射后第 8 d 处死小鼠所剥离肿瘤，其肿瘤体积 CD47-/-组大于 WT 组。在注射后第 11,14 d 处死小鼠测量肿瘤所得结果显示同样的趋势，即肿瘤体积 CD47-/-组大于 WT 组。小鼠处理情况同前，选取肿瘤长径 1/3，1/2 分别将肿瘤纵剖面的全部区域切割成组织块，每块至少制作 2 张切片镜下观察，以减少选择性偏差。显微镜下观察组织坏死情况，主要表现为大片凝固性坏死，细胞崩解甚至消失，结果显示，注射同期 WT 小鼠与 CD47-/-小鼠相比，其肿瘤坏死程度较 CD47-/-小鼠大，坏死出现时间（5 d，较少，集中于肿瘤中心部位）较 CD47-/-小鼠早（11 d 出现，预实验显示 20 d 出现明显坏死）。部分预实验显示，至肿瘤注射后第 25 d 左右，WT 小鼠及 CD47-/-小鼠其肿瘤内均可见大面积坏死。
......
第 3 章 体内实验.....................................................293.1 试验步骤： .....................................................293.1.1 小鼠肿瘤模型的建立： ...................................293.1.2 免疫组化染色： ............................................303.1.3 图片及数据统计分析： ......................................33第 4 章 体外实验......................................................454.1 实验方法与操作 .................................................454.1.1 内皮细胞分离纯化及培养传代 ..................................45第 5 章 全文结论................................................65
第 5 章 全文结论
1.通过体内实验发现 CD47 缺失加快肿瘤血管新生，且肿瘤抗坏死能力增强。2.通过体外实验发现，CD47 参与内皮细胞衰老，成管，增殖等生理过程。3.CD47 参与细胞有丝分裂的调节，CD47 缺失促进内皮细胞的有丝分裂。4.CD47 参与部分细胞周期调控蛋白的调节，CD47 缺失使内皮细胞 p53 基因，p21 基因表述水平下调，c-myc 基因表述水平上调。
......
第 6 章 全文讨论
而 CD47 对内皮细胞的功能调节机制最早发现于上个世纪 90 年代，其机制主要是通过其配体血小板反应蛋白 1（TSP-1）与血管内皮细胞生长因子受体 2进行结合，虽然已有研究表明 CD36 能与 TSP1 结合并且发挥相似的功能，但是CD47 与 CD36 结合 TSP-1 的灵敏度相差巨大，CD36 需要 TSP-1 的浓度在纳摩尔级别才会进行结合，而 CD47 只需要 TSP-1 的浓度在皮摩尔级别就会被活化，而在正常生理环境下组织内的 TSP-1 的浓度是低于纳摩尔级别的，因此在这种情况下 CD47 通过 TSP-1 对血管新生的调节功能更为重要。2021 年自然子期刊Scientific Report 报道 CD47 缺失的内皮细胞出现永生化现象，并且细胞重获干性，能够定向诱导分化成为非内皮细胞特征的其他类型细胞，同时上调干性相关的因子如 c-myc。尽管这篇文章之后没有相关报道出现，但是在我们课题组对 CD47缺失的内皮细胞进行研究期间，获得过唯一一次因为 CD47 缺失，诱发内皮细胞出现永生化，并且也观察到 c-myc 水平升高。这一发现将 CD47 在内皮细胞中的功能调节作用提升到了一个新的高度，揭示 CD47 作为参与细胞干性调控的因子的巨大潜力。本课题旨在通过在 CD47-/-小鼠肿瘤模型中，对比肿瘤的生长速度以及坏死面积，并通过一系列分子生物学以及免疫学研究对 CD47 参与肿瘤血管新生的新机制进行解析。首先我们发现 CD47-/-小鼠体内的肿瘤生长速度更快，重量更大，而且中心坏死出现的时间更晚，面积更小。通过免疫学研究我们发现，在 CD47-/-小鼠体内肿瘤组织的血管新生情况要更加旺盛。肿瘤组织的快速发展往往会引起中心区域由于血供不足以及炎症因子带来的坏死，这一现象在 WT 小鼠中在注射肿瘤细胞 10 d 后被观测到，但是在 CD47-/-小鼠的肿瘤组织中这一现象的出现有显著的延迟（从 14 d 开始），并且坏死的面积也明显的小于 WT 小鼠。并且我们发现 CD47-/-小鼠的肿瘤组织中巨噬细胞的数量明显低于野生型小鼠，同时肿瘤坏死因子 （TNF- ）的表述明显下调（由于涉及到工作组其他成员的文章发表数据未列出）。鉴于 CD47 缺失会诱发细胞永生化以及细胞干性的重现，我们针对肿瘤组织中的内皮细胞进行纯化分离，结果发现与 13 年文献报道相同 c-myc的表述在 CD47 缺失小鼠中特异性的上调，细胞在体外传代次数明显增加。我们在随后的半乳糖苷酶染色试验中发现 CD47-/-小鼠的肿瘤组织的内皮细胞的衰老进程明显缓于野生型小鼠。根据细胞生物学的研究表明，细胞衰老与细胞周期的调节密切相关，真核细胞能否连续进行分裂，很大程度上取决于细胞自身现实以及周围环境，而自身现实适宜与否主要是通过 G0/1 期的检测点（R point）完成我们针对这部分内皮细胞的细胞周期进行分析，结果发现 CD47 缺失引起更多的细胞通过 R point 进入到 G1 期。随后我们又针对参与细胞凋亡的因子进行了基因水平的检测，结果发现 CD47 缺失可以诱导 p53 的特异性下调，作为促进细胞凋亡的主要因子，p53 在众多肿瘤细胞中都有下调机制从而逃逸凋亡，提示 CD47参与细胞凋亡调控。同时我们还发现，CD47 缺失会诱发内皮细胞更强的成管能力，成管能力作为内皮细胞功能的一个重要指标，提示 CD47 对内皮细胞平面极化可能存在调控机制。另外，在 CD47-/-小鼠的肿瘤组织中，TSP-1 的表述有明显下调趋势，TSP-1 作为炎症因子介导细胞衰老以及影响巨噬细胞活性，但是正如前文中提到的，TSP-1 不仅能与 CD47 结合，在高浓度的情况下还会与 CD36 结合发挥功效，在本次研究中并没有对 CD36 的作用进行评估，原因之一是在肿瘤组织中的 TSP1 水平与正常组织中的 TSP-1 水平并无差异，在皮摩尔级别，因此可能无法激活 CD36 活性。
......
参考文献(略)