MALP 支原体
第1章前言
条件致病支原体主要包括发酵支原体（M.fermentans）、穿透支原体（M.perans）和梨支原体（M.pirum）。支原体主要引起人类呼吸系统和泌尿生殖系统感染[7]。前者主要表现为原发性非典型肺炎，少数患者还可以引起上呼吸道感染、支气管炎、肺脓疡，甚至严重的肺外并发症，如免疫性溶血性贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎等[8,9]。泌尿生殖道感染主要表现为非淋菌性尿道炎、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、产后热、早产、低体重新生儿及新生儿肺炎、脑膜炎、败血症等[1,10]。此外，支原体也可能在AIDS的发展过程中起辅助因子或促进因子的作用[11]。支原体致病机制目前尚未完全明了，多种途径参与了支原体感染后的宿主细胞或组织损伤[2,3]。目前已经明确的致病机制包括：（1）掠夺宿主细胞营养物质。支原体几乎丧失了所有合成氨基酸、脂肪酸、辅助因子、维生素的能力，其生物大分子的合成需要宿主提供相应的前体物质[3]。这种竞争关系的存在可能导致宿主细胞功能受损；（2）黏附宿主细胞或与感染细胞融合。支原体黏附于宿主细胞后能干扰细胞膜表面受体的功能。部分支原体也能产生许多有毒的代谢产物、溶细胞酶、氧自由基等[12,13]。尤其是和宿主细胞融合时，支原体内一些酶类，包括水解酶、核酸酶、磷蛋白磷酸酶等也随之转移至宿主细胞当中[4]，这些物质对宿主细胞具有损伤作用；（3）表面抗原变异，逃避免疫系统的监视；（4）表述有机氢过氧化物酶类，降解吞噬细胞产生的活性氧类而逃避免疫系统的清除[14,15]；（5）调控宿主免疫系统。包括引起自身免疫应答和免疫功能紊乱，直接或间接参与组织损伤[16-20]。上述众多机制当中，支原体感染诱导的炎症损伤及免疫功能紊乱在各种炎症相关疾病以及肺外并发症中发挥主要作用[21-23]。支原体缺乏细胞壁，因此其细胞膜是支原体与宿主细胞相互作用的唯一结构[21]。支原体细胞膜主要是由脂质双层和脂蛋白（也称为脂质相关膜蛋白，lipid-associatedmembraneproteins，LAMPs）组成。通过对其结构分析显示，所有膜脂蛋白的N端均由二酰甘油半胱氨酸和与之结合的两条脂肪酸链组成[24]。与其他细菌脂蛋白相比，支原体膜脂蛋白半胱氨酸残基中含有一个自由的氨基（二酰脂蛋白），而在细菌膜脂蛋白中，此氨基通常与脂肪酸链结合（三酰脂蛋白）。支原体膜脂蛋白通过二酰甘油半胱氨酸结构而锚定于宿主细胞膜上，具有抗原性，并能以高频率发生相位、抗原变异，形成多样化的支原体表面[25]。研究显示，支原体膜脂蛋白N末端的二酰甘油半胱氨酸结构是活化单核、巨噬细胞的基础，而与氨基酸链的长度关系不大[26]。根据支原体膜脂蛋白的这一特征，Mühlradt等人工合成了一14个氨基酸长度、分子量为2Da的脂肽，该脂肽含有2分子棕榈酸（C16:0），其结构为Pam2CGNNDESNISFE（C99H167N19O30S）[27]。体外研究显示，该脂肽是激活巨噬细胞最强的因子之一，因此称为巨噬细胞活化脂肽2（macrophage-activatinglipopeptide-2，MALP-2）[28,29]。在研究支原体膜脂蛋白功能时，由于膜脂蛋白往往与膜结合十分紧密，提取膜脂蛋白需要用去垢剂（detergent）使细胞膜裂解后才可分离出来，从而增加内毒素污染的机会。而人工合成的MALP-2具有几乎所有支原体膜脂蛋白的免疫刺激活性，因此被广泛应用于支原体感染以及各种免疫机制相关研究[30,31]。支原体膜脂蛋白是其主要的致炎物质。在感染早期，支原体膜脂蛋白（或MALP-2）可被固有免疫系统的模式识别受体（pattern-recognitionreceptor）所识别并迅速激活单核、巨噬细胞[3,21,29]。参与支原体识别的模式识别受体主要是Toll样受体2（Toll-liereceptor2，TLR2）和TLR6[32-34]。TLR2和TLR6通过其胞外亮氨酸重复序列区域（leucinerichrepeat，LRR）对支原体脂蛋白识别后，可诱导自身形成异二聚体，并后通过其TIR区（Toll-IL-1receptordomain）募集接头分子Mal和MyD88与之结合，随后MyD88通过其死亡结构域（deathdomain）与丝/苏氨酸蛋白激酶IRA相互作用,导致IRA发生自身磷酸化而激活泛素连接酶肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TNF-receptor-associatedfactor6,TRAF6）。TRAF6随后与转化生长因子-β活化激酶及TA1结合蛋白TAB1/2形成复合物,最后激活核因子&appa;B（nuclearfactor&appa;B，NF-&appa;B）[35,36]。此外，TRAF6还可与ECSIT（evolutionarilyconservedintermediateinTollpathways）相互作用，再依次激活丝裂原蛋白激酶（mitogen-activatedproteininase，MAP）和激活蛋白-1（activatorprotein1,AP-1）[37]，NF-&appa;B，AP-1和MAPs激活后可诱导免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞以及神经胶质细胞等产生一系列促炎细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6以及IFN-γ、IL-8、前列腺素、单核细胞趋化蛋白1、粒-单核细胞集落刺激因子等细胞因子和介质的表述而参与免疫应答[16-20]。目前已经证实机体对感染性炎症反应的调节主要通过负向调控TLR通路以及合成和产生多种具有抗炎或细胞保护性作用产物而实现的[40-43]。对TLR的负向调控主要包括：（1）胞外负调控因子。可溶性TLR是一种胞外负调控因子，它在TLR信号通路的初始阶段发挥调控作用，从而减弱TLR信号，阻止急性炎症反应的发生。如在人腮腺涎中存在可溶性TLR2分子，可在一定程度上阻止配体与TLR2的结合而抑制信号的起始[44]。（2）跨膜负调控分子。肿瘤发生抑制物2（suppressoroftumorigenicity，ST2）可促进接头分子MyD88和Mal解离，从而抑制NF-&appa;B的活化[39]。单免疫球蛋白IL-1相关蛋白（Singleimmunoglobulininterleuin-1receptorrelatedprotein，SIGIRR）可抑制IRA和TRAF6形成复合体，从而干扰IRA和TRAF6复合物的形成，抑制信号转导[45]。TAM受体酪氨酸激酶胞外区可与配体结合，胞内区具有酪氨酸激酶活性结构域，它激活后能与I型干扰素受体（typeIinterferonreceptor，IFNR1）结合而激活转录因子STAT1[46]。活化的STAT1能够促进细胞因子信号抑制蛋白-1（suppressorsofcytoinesignaling-1，SOCS-1）和SOCS-3的表述，SOCS-1能够泛素化降解Mal，而SOCS-3则可以泛素化降解TRAF6，从而抑制TLR信号通路[44]。肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体受体（tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligandreceptor，TRAILR）能够维持I&appa;B-α的稳定，抑制NF-&appa;B的活化，从而阻止其核转位诱导炎症因子的产生[47]。（3）胞内负调控因子。SOCS家族成员都含有一个保守的Src同源序列SH-2，在C端含有一个稀有的羧基模序，称为SOCS框。SOCS家族有8个成员，SOCS-1与SOCS-3关系最为紧密。SOCS-1能够靶向结合Mal并使其泛素化降解，从而直接调控TLR2和TLR4介导的信号通路[44]。在TLR2信号通路中，CYLD能够泛素化降解TRAF6和TRAF7，抑制NF-&appa;B和p38的激活[48]。此外，MyD88包含有一个N端死亡结构域。它能与C端结构域相连形成同源二聚体。有一种短剪接突变体MyD88（MyD88s），在MyD88s存在下，MyD88s与MyD88优先形成异二聚体，阻碍了MyD88同源二聚体的形成，使IRA4不能结合到该信号复合物上，由此抑制IRA1的磷酸化而调控激活NF-&appa;B信号通路[49]。
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第2章材料与方法2.1实验仪器与材料1主要实验仪器低温高速离心机（5418R）德国Eppendorf台式冷冻离心机（5810R）德国Eppendorf全自动酶标仪（SynergyHT）美国Bio-Te半干转印槽（Trans-BlotSD）美国Bio-Rad垂直电泳槽（Mini-PROTEAN）美国Bio-Rad甩片机（StatSpinCytoFuge2）香港威士达2细胞株THP-1细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。3主要实验试剂（1）试剂盒试剂盒商家SYBGreenPCRMixRocheAppliedScienceTRIZolInvitrogenRevertAidTMFirststrandcDNASynthesisitFermentasNF-&appa;Bp65transcriptionfactorELISAitAffymetrix（Panomics）（5）培养基及溶液PBS、RPMI-1640培养基为Hyclone产品，SDS-PAGE缓冲液、Westernblot转膜液等均按照《分子克隆实验指南》附录部分配制。（6）其它HO-1和Nrf2siRNA由Ribio公司合成嘌呤霉素（Puromycin）购自Sigma-Aldrich；博莱霉素（Zeocin）购自Invitrogen；PVDF膜购自Millipore；胎牛血清购自GIBCO；蛋白预染Marer购自Fermentas；X感光胶片购自oda；细胞培养板及培养瓶购自Corning-Costar；其他生化试剂主要购自上海生工生物工程公司和Sigma-Aldrich等公司。
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2.2技术路线1TLR2,6在介导HO-1表述中的作用
人单核细胞系THP-1细胞用RPMI-1640培养基（含2mmol/L谷氨酰氨、10%胎牛血清、100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素G），于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。观察细胞生长丰度，当悬浮细胞布满整个视野或培养基变黄时，1,000rpm离心5min收集细胞，弃培养基，PBS漂洗1次并分成2～3瓶，加入含10%胎牛血清的新鲜完全培养基继续培养。将培养的THP-1细胞于1,000rpm离心5min，弃上清，加入无菌PBS漂洗1次。离心并接种于6孔板或24孔板中（根据不同的实验目的而定），调整其密度为105/mL，37℃、5%CO2条件下培养24h。随后加入终浓度为5ng/mLMALP-2作用不同时间（视不同实验而定），随后收集THP-1细胞并提取其蛋白用于下一步研究。在进行抑制剂实验时，接种于6孔板或24孔板中的细胞预先用不同浓度的抑制剂处理（时间视不同实验而定），随后加入终浓度为5ng/mLMALP-2作用不同时间。培养于6孔板中的THP-1细胞经MALP-2处理结束后，用预冷PBS漂洗2次，随后加入含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂（Coctails）的细胞裂解液冰上裂解细胞，随后4℃，12,000rpm离心10min，获取上清用于SDS-PAGE或置于-70℃保存。
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第 3 章 结果.....................................................433.1 MALP-2经TLR2和TLR6诱导THP-1细胞表述HO-1............433.2 c-Src参与MALP-2诱导THP-1细胞表述HO-1........................ 473.3 HO-1表述受Bt调控............................................503.4 MALP-2经MyD88非依赖性途径诱导THP-1细胞表述HO-1.............543.5 Mal参与HO-1表述............................................56第 4 章 讨 论..................................................81第 5 章 结 论....................................................91
第4章讨论
支原体膜脂蛋白是支原体感染后所致炎症反应的主要致病物质。在研究支原体与宿主免疫系统相互作用时，从某种程度上而言，直接采用膜脂蛋白作用于细胞更真实接近体内的实际情况，但在提取膜脂蛋白过程中涉及到支原体培养和去垢剂使用等多个环节，大大增加了内毒素污染的几率[90]。单核细胞本身对内毒素十分敏感，一旦膜脂蛋白中混有内毒素，很难用常规手段去除，从而其生物学活性容易被内毒素掩盖[90]。由于膜脂蛋白激活单核/巨噬细胞取决于其N末端的二酰-甘油半胱氨酸结构而非氨基酸序列，而基于其N端通用结构人工合成的MALP-2具有几乎所有膜脂蛋白的致炎活性，因此常用于作为TLR/6的激动剂或用作支原体膜脂蛋白的替代品而被本研究所采用。HO-1最原始的功能是催化血红素降解为CO、Fe2+和胆红素的限速酶。近年来的研究发现，HO-1不但参与氧化应激反应，而且在多种病原微生物的感染过程中发挥重要的免疫调控作用[91-93]。本课题组的前期研究表明，肺炎支原体、生殖支原体膜脂蛋白分别可诱导单核细胞和子宫内膜细胞表述HO-1（尚未发表资料）。进一步采用MALP-2研究其机制后发现，HO-1的表述有赖于持续的转录和翻译，且该过程可能受核转录因子Nrf2的调控[72]。在本研究中我们对MALP-2调控HO-1的机制进行了深入探讨，得到了以下重要发现：第一，MyD88并不直接参与介导MALP-2诱导HO-1表述，相比之下，HO-1的表述直接依赖于Mal；第二，非受体酪氨酸蛋白激酶c-Src和Bt直接介导Mal参与下游信号级联通路，最终形成c-Src/Bt/Mal/MyD88/PI3复合体而激活核转录因子Nrf2；第三，HO-1表述后可在一定程度上负向调控细胞因子分泌及NF-&appa;B活性，从而发挥免疫调控和细胞保护作用。机体固有免疫系统中的单核细胞和巨噬细胞是支原体感染后诱发炎症反应的主要效应细胞[94]。在哺乳动物体内，单核、巨噬细胞主要依赖其细胞膜上的TLR2和TLR6识别支原体膜脂蛋白。在一些辅助受体的协助下，脂蛋白与TLR2和TLR6结合可诱导其发生构象改变并形成TLR2/6异二聚体，随后激活一系列丝/苏氨酸和酪氨酸激酶，包括IRAs、TRAF6和MAPs，最终导致多种核转录因子的激活而启动炎症相关介质的表述和分泌[95]。这些炎性介质能诱导白细胞和内皮细胞表述主要组织相容性复合物Ⅰ类和Ⅱ类分子及炎性细胞渗出[18]。尽管这些炎症介质的产生能增强固有免疫系统清除支原体，但另一方面也可能引起炎症失控或加重局部组织损伤[96,97]。因此，支原体感染后，机体必须具备严格的负调控机制以维持炎症反应的平衡，否则一旦反应平衡被打破，则可能引起严重的病理损伤甚至自身免疫的发生[96,98]。本课题组的前期研究也证实，MALP-2作用于单核细胞后，可诱导其表述HO-1，而后者可以抑制环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）的过度表述，从而发挥对炎症反应的调控作用[72]。为了观察TLR2和TLR6是否参与介导MALP-2诱导单核细胞表述HO-1，本研究通过采用TLR2和TLR6中和抗体以及负显性突变体两种方法抑制或阻断其信号通路后，结果显示TLR2和TLR6均参与了MALP-2诱导HO-1的表述。鉴于HO-1在微生物感染以及免疫调节中的积极作用，因此MALP-2在激活炎症信号通路的同时，也通过TLR2/6途径诱导HO-1的表述，这可能是机体为了维持内环境稳态而形成的一种调节机制[31]。研究显示，在感染的初期或低浓度MALP-2处理对TLR2信号的激活有利于保护性免疫反应的发生，从而促进病原体的清除[99]，此时HO-1表述的生理意义可能是为了拮抗吞噬细胞分泌的各种活性产物所致的自身损伤而产生的一种细胞保护作用，因为单核、巨噬细胞在生理条件下也表述一定水平的HO-1，而在该现实下HO-1并无免疫调控作用。若感染因素持续存在，后期产生的HO-1还可能通过血红素的降解产物发挥免疫调控作用。此外，炎症反应过程中免疫系统产生的各类炎症介质，如ROS、TNF-α、前列腺素衍生物等物质还可再次通过NADHP氧化酶/Nrf2途径诱导一系列II相解毒酶和抗氧化基因的表述（如HO-1、NQO1、GST、GCL），这些分子可从多方面调控单核、巨噬细胞功能，并对TNF诱导的细胞凋亡具有抑制作用，从而避免失控性炎症反应或过度凋亡的发生[100]。
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第 5 章 结 论
（1）支原体 MALP-2 经 TLR2,6/c-Src/Bt/Mal/PI3/Nrf2 通路诱导THP-1 细胞表述 HO-1；（2）HO-1 可负向调控 THP-1 细胞分泌 TNF-α和 IL-1β。
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参考文献(略)