基于功能作用纳米材料的传感器设计及在医学中的价值
第一章绪论
诊断是所有疾病有效治疗基本程序,因此把重点放在诊断工具上是十分必要的。虽然在治疗或预防方面的能力提高是克服疾病十分重要的因素,然而没有准确和及时的诊断可能会危及生命。 对于常规的临床诊断方面,免疫诊断被广泛使用,在酶联免疫吸附试验(ELISA)仍是生理样品中的蛋白质检测的是金标准检。酶联免疫吸附原理一直在扩展和调整,以提高其性能。然而,该技术具有固有的局限性,如需要许多洗涤步骤,这严重限制了速度。目前已经有很多科研工作集中在开发定量侧向流动装置上,如那些用于妊娠试验和现场的快速测试装置,它们与ELISA相比确实缩短了时间。但是, 一般这样的设备可以与 ELISA 法比,在检测限方面没有竞争力。聚合酶链反应(PCR),十分优秀的核酸检测方法,但是这个过程是复杂的,需要例如扩增步骤,通常并不适宜快速诊断。
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第二章 基于 DNA 纳米结构的分子逻辑门用于 RNA 分子诊断
2.1 引言
DNA Origami 是有 200 多条 DNA 短链和一条病毒 DNA 根据碱基互补配对原理杂交而成的纳米结构[12]。DNA Origami的表面是可定位的,可用于修饰多种分子和配体[13],比如核酸,抗体[14],激素,生物标记物[15]等等。它也可以用于高效和可定位的药物运输和释放[14, 16]。DNA Origami 的潜在应用价值已经吸引了各个领域的兴趣,包括纳米光学[17]和生物医学研究。这里我们尝试在 DNA Origami 上设计一种逻辑门,分析两种疾病标记物来综合诊断疾病现实。之前的临床研究表明一种疾病经常跟多个基因标记物关于,他们的逻辑现实关系经常表现出不同的疾病现实[18]。特别是各种疾病的 MicroRNA 表述图谱也表明相对于正常细胞而言,疾病细胞的 mcroRNA 表述图谱存在多种现实,而不同现实则代表了不同的疾病现实[19-21]。我们选择了心力衰竭的两个生物标记物,miroRNA-21(miR-21)[22]和microRNA-195(miR-195)[23]作为逻辑门的输入信号。我们设计的逻辑门包含了两个部分,分别是计算模块和输出模块。计算模块可以接收输入信号并分析输入信号,而输出模块则可以根据不同的计算结果显示出不同的符号。两种模块由一种传导 DNA 介导,它可以将信号从计算模块传到输出模块。DNA Origami 的输出结果可以使用原子里显微镜观察到。
2.2 实验部分
长方形的DNA Origami纳米结构是根据Rothemud方法合成。具体方法是,M13mp18 DNA 与 200 多条 DNA 短链按 1:5 的比例混合(5 nM M13mp18 DNA, 25 nM 的短链DNA 溶于 1×TAE,Mg2+(Tris, 40 mM; 乙酸,20 mM; EDTA,2mM; 乙酸镁,12.5 mM; pH8.0)的缓冲液里。Bloc DNA(终浓度:200nM)在退火之前加入溶液里。然后混合物在PCR仪里从95°缓慢降到19°C(每分钟降0.1°C)。退火之后,YES gate DNA 或者 AND gate DNA(500 nM)与 gate stable 在 35°C杂交 30 min。最后,将混合物用100超滤管超滤(3000g, 10 min,4 times),每次使用1 × TAE/Mg2+清洗。每次会回收大约 40 μL 2.5 nM的DNA Origami。
第三章基于金-银双金属纳米结构的 SERS探针用于 DNA多元检测.............. 73
3.1 前言............................... 73
3.2 实验部分...................... 74
第四章基于石墨烯的纳米探针用于光学生物传感器平台..................... 87
4.1 前言...................... 87
4.2 实验部分.............88
第五章总结与展望.......................... 101
第四章基于石墨烯的纳米探针用于光学生物传感器平台
4.1 前言
癌症早期诊断对于癌症治疗十分重要,对全世界科学家来说仍然充斥着挑战[17]。生物蛋白标记物的准确诊断在癌症早期诊断十分关键,同时也十分困难,因为在癌症早期病人血液里只要极少量的蛋白标记物[18-20]。通常情况下,传统的方法如酶联免疫吸附实验(ELISA),放射免疫实验(RIA),荧光免疫实验(FIA)被用于检测这些癌症标记物。然而,这些技术并不能满足更高的检测灵敏度,因为癌症早期诊断变得越来越重要[21, 22]。最近在纳米扩增技术方面有很大进展,然而这些技术大多数都面临很多问题如复杂的组装过程,生物功能化纳米材料的不稳定性[23-25]。例如,为了在纳米材料表面有效固定酶分子,首先需要复杂和繁琐的程序修饰基底表面[26, 27]。零维纳米材料如纳米金由于有限的表面不能有效满足基于纳米材料的信号扩增,特别是当酶或者生物大分子如免疫球蛋白需要共组装到一个纳米颗粒上时[28-31]。
4.2 实验部分
200μL GO(0.5mg/ml)与不同浓度的 HRP 混合于 PB buffer(50mM, pH 7.0)里,混合物在Eppendorf 里以300rpm室温振荡 4h。孵育后,混合物在 10,000rpm下离心,除去上清液,再加入新的buffer。一般需要经过5次离心洗涤可以将多余的HRP 洗去。上清液经过回收并使用μBCA 实验进行蛋白定量。吸附在 GO 上的酶数量可以测量与GO混合前后的吸光度来计算。为了制备基于GO的探针(anti-IgG-GO-HRP),200μL GO(0.5mg/ml)与不同浓度的 HRP 和 anti-IgG 混合于0.1M PBS,混合物在 Eppendorf 上以 300rpm 室温振荡 10h。然后,加入50μL 5% BSA溶液封闭GO 1h。孵育之后,混合物以 10,000 rpm离心,除去上清液。最后的沉淀物重悬于500μL 0.1M PBS,并放置4°C以备用。
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第五章总结与展望
本论文将功能化纳米材料与 DNA 纳米技术相结合,制备了SERS 探针,石墨烯,DNA Origami的生物传感器,实现对多种生物分子的高灵敏检测和多元分析。主要内容如下:
1. 基于 DNA Origami 的逻辑门设计及在 RNA 诊断中的应用 以DNA Origami 为构架,设计了用于分析 microRNA 的逻辑门。逻辑门有三个组成部分:输入模块,计算模块和输出模块。输入模块将 microRNA 作为输入信号,计算模块分析输入信号并将结果传递给输出模块,输出模块将计算结果显示出来。使用原子力显微镜实现了对逻辑门计算结果和 microRNA 诊断结果的可视化观察。
2.基于 Au-Ag SERS 探针的制备用于病毒 DNA 的高灵敏度和多元检测制备了Au-Ag SERS 探针,用于病毒 DNA的高灵敏度检测和多元 DNA 分析。另外,这种探针可以分别使用荧光分子和巯基小分子作为拉曼分子,增加了多元检测和成像的应用前景。
3.基于氧化石墨烯的纳米探针制备及用于癌症标志物 AFP 的检测。
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参考文献(略)